Perfil de micrornas circulantes e gravidade em pacientes com anemia falciforme
Data
2018-12-13
Autores
Biassi, Thais Priscila 
Orientadores
Figueiredo, Maria Stella
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Background: Sickle cell anemia (SCA) is a complex disease, associated with
hemolysis, vasoocclusion,
vascular inflammation and endothelial activation.
Significant morbidity and premature mortality are hallmarks of the disease and
elevation of tricuspide regurgitant velocity (TRV), determined by dopplerechocardiography,
has been associated with higher risk. The identification of
biomarkers associated with severity in SCA is desirable. Circulating serum
microRNAs (miRNA) are molecular targets studied in different diseases as
diagnostic or prognostic markers, however there are few studies in
SCA.Purpose: to identify specific signatures of miRNAs in plasma samples of
SCA patients according to severity indexes. Methods: Screening of the miRNAs
expression was performed in 8 patients. These patients were classified by TRV
measure (referred as TRV Score): 4 samples with TVR ≥ 2.5 m/s and 4 with TRV
< 2.5 m/s. After extraction of total RNA, the samples were analyzed by realtime
PCR using Megaplex RT Human Pool A and Megaplex RTHuman Pool Blife
(Thermofisher) comprising 667 distinct miRNAs. Expression Suite Software
(Thermofisher) and SPSS were used for analysis. Seventeen miRNAs were
differentially expressed between the two groups (p < 0.05) and miR16 was
considered as the endogenous candidate. Five differentially expressed miRNAs
(miR15b, miR502, miR510, miR544, miR629) were selected for validation in 56
patient samples using TRV Score. Another two severity scores were also used: (a)
Organ Injury Score (SLO) – based on the presence or absence of 5 lesions:
stroke, TRV ≥ 2.5 m/s, leg ulcers, osteonecrosis, and microalbuminuria (adapted
from AfenyiAnnan
et al. Transfusion 2008; 48:197) and (b) NIH Bayesian score –
available online (http://bios.ugr.es/dsscalculator/).
The ROC curve was used to
analyze the data of relative expression (2ΔCT)
of each miRNA.Results: Two out of
five miRNA, miR510 and miR629, were significantly decreased in more severe
patients. The miR510 expression allowed the discrimination of the patients
according to TRV Score at the cutoff 0,000367664, sensitivity 68,4%, specificity
81.2% and 0,773 (95% IC: 0,6110,935,
p = 0,006). The same miRNA was also a
good discriminant in the SLO at a cutoff of 0.000331043, sensitivity 70,6%,
specificity 72.2% and area under the curve (AUC) of 0.716 (95% CI: 0,5370,894)
p
= 0.029.The miR629 was related to severity according to the Bayesian Score at
the cutoff of 0.0009854449, sensitivity 66.7%, specificity 75% and AUC of 0.729
(95% CI: 0,5270,897,
p=0,047). The other miRNAs, miR15b, miR502 and
miR544, showed no significant results.Discussion and Conclusions: This is the
first study thatlooks into plasma miRNA as a biomarker of SCA severity. The
miR510 regulate Peroxirredoxin1
(PRDX1), a protein involved in the stressoxidation.
Increased oxidative stress presented in SCA might imply that miR510
has a role in this mechanism. The miR629 appears to be involved in the AKT1
signaling pathway related to Endothelin1.
As it is known, endothelin1
is increased in SCA and is important in pulmonary hypertension. The miR510 and
miR629 appear to be hypoexpressed in patients with more severe SCA, probably
with greater importance in the regulation of clinical manifestations associated with
vascular disease, although more studies seem to be necessary.
Introdução: A anemia falciforme (AF) é uma doença complexa, associada à hemólise, vasooclusão, inflamação vascular e ativação endotelial. A morbidade significativa e a mortalidade prematura são características marcantes da doença e a elevação da velocidade do regurgitante tricúspide (VTR), determinada pelo ecodopplercardiograma, tem sido associada a maior risco. A identificação de biomarcadores associados à gravidade na SCA é desejável. Os microRNAs séricos circulantes (miRNA) são alvos moleculares estudados em diferentes doenças como marcadores diagnósticos ou prognósticos, no entanto, existem poucos estudos em SCA. Objetivo: identificar assinaturas específicas de miRNAs em amostras de plasma de pacientes com AF de acordo com os índices de gravidade. Métodos: A triagem da expressão dos miRNAs foi realizada em 8 pacientes. Esses pacientes foram classificados pela medida TRV (referido como TRV Score): 4 amostras com TVR ≥ 2,5 m/s e 4 com TRV <2,5 m/s. Após a extração do RNA total, as amostras foram analisadas por PCR em tempo real usando Megaplex RT Human Pool A e Megaplex RTHuman Pool Blife (Thermofisher) compreendendo 667 miRNAs distintos. O software Expression Suite (Thermofisher) e o SPSS foram utilizados para análise. Dezessete miRNAs foram diferencialmente expressos entre os dois grupos (p <0,05) e miR16 foi considerado o candidato endógeno. Cinco miRNAs diferencialmente expressos (miR15b, miR502, miR510, miR544, miR629) foram selecionados para validação em 56 amostras de pacientes utilizando o TRV Score. Outros dois escores de gravidade também foram utilizados: (a) Pontuação de Lesão Orgânica (SLO) baseada na presença ou ausência de 5 lesões: acidente vascular cerebral, TRV ≥ 2,5 m / s, úlceras de perna, osteonecrose e microalbuminúria (adaptado de AfenyiAnnan). et al., Transfusion 2008; 48: 197) e (b) NIH Bayesian score disponível online (http://bios.ugr.es/dsscalculator/). A curva ROC foi utilizada para analisar os dados de expressão relativa (2ΔCT) de cada miRNA. Resultados: Dois dos cinco miRNA, miR510 e miR629, foram significativamente diminuídos em pacientes mais graves. A expressão do miR510 permitiu a discriminação dos pacientes de acordo com o TRV Score no cutoff 0,000367664, sensibilidade 68,4%, especificidade 81,2% e 0,773 (95% IC: 0,6110,935, p = 0,006). O mesmo miRNA também foi um bom discriminante no SLO em um ponto de corte de 0,000331043, sensibilidade de 70,6%, especificidade de 72,2% e área sob a curva (AUC) de 0,716 (95% CI: 0,5370,894) p = 0,029. O miR629 foi relacionado à gravidade de acordo com o escore bayesiano no ponto de corte de 0,0009854449, sensibilidade de 66,7%, especificidade de 75% e AUC de 0,729 (IC 95%: 0,5270,897, p = 0,047). Os outros miRNAs, miR15b, miR502 e miR544, não apresentaram resultados significativos. Discussão e Conclusões: Este é o primeiro estudo que analisa o miRNA plasmático como um biomarcador da gravidade da SCA. O miR510 regula a Peroxirredoxina1 (PRDX1), uma proteína envolvida na oxidação do estresse. O aumento do estresse oxidativo apresentado na SCA pode implicar que o miR510 tem um papel nesse mecanismo. O miR629 parece estar envolvido na via de sinalização de AKT1 relacionada à endotelina1. Como é sabido, a endotelina1 está aumentada na AF e é importante na hipertensão pulmonar. Os miR510 e miR629 parecem estar hipoexpressos em pacientes com AF mais grave, provavelmente com maior importância na regulação das manifestações clínicas associadas à doença vascular, embora mais estudos pareçam ser necessários.
Introdução: A anemia falciforme (AF) é uma doença complexa, associada à hemólise, vasooclusão, inflamação vascular e ativação endotelial. A morbidade significativa e a mortalidade prematura são características marcantes da doença e a elevação da velocidade do regurgitante tricúspide (VTR), determinada pelo ecodopplercardiograma, tem sido associada a maior risco. A identificação de biomarcadores associados à gravidade na SCA é desejável. Os microRNAs séricos circulantes (miRNA) são alvos moleculares estudados em diferentes doenças como marcadores diagnósticos ou prognósticos, no entanto, existem poucos estudos em SCA. Objetivo: identificar assinaturas específicas de miRNAs em amostras de plasma de pacientes com AF de acordo com os índices de gravidade. Métodos: A triagem da expressão dos miRNAs foi realizada em 8 pacientes. Esses pacientes foram classificados pela medida TRV (referido como TRV Score): 4 amostras com TVR ≥ 2,5 m/s e 4 com TRV <2,5 m/s. Após a extração do RNA total, as amostras foram analisadas por PCR em tempo real usando Megaplex RT Human Pool A e Megaplex RTHuman Pool Blife (Thermofisher) compreendendo 667 miRNAs distintos. O software Expression Suite (Thermofisher) e o SPSS foram utilizados para análise. Dezessete miRNAs foram diferencialmente expressos entre os dois grupos (p <0,05) e miR16 foi considerado o candidato endógeno. Cinco miRNAs diferencialmente expressos (miR15b, miR502, miR510, miR544, miR629) foram selecionados para validação em 56 amostras de pacientes utilizando o TRV Score. Outros dois escores de gravidade também foram utilizados: (a) Pontuação de Lesão Orgânica (SLO) baseada na presença ou ausência de 5 lesões: acidente vascular cerebral, TRV ≥ 2,5 m / s, úlceras de perna, osteonecrose e microalbuminúria (adaptado de AfenyiAnnan). et al., Transfusion 2008; 48: 197) e (b) NIH Bayesian score disponível online (http://bios.ugr.es/dsscalculator/). A curva ROC foi utilizada para analisar os dados de expressão relativa (2ΔCT) de cada miRNA. Resultados: Dois dos cinco miRNA, miR510 e miR629, foram significativamente diminuídos em pacientes mais graves. A expressão do miR510 permitiu a discriminação dos pacientes de acordo com o TRV Score no cutoff 0,000367664, sensibilidade 68,4%, especificidade 81,2% e 0,773 (95% IC: 0,6110,935, p = 0,006). O mesmo miRNA também foi um bom discriminante no SLO em um ponto de corte de 0,000331043, sensibilidade de 70,6%, especificidade de 72,2% e área sob a curva (AUC) de 0,716 (95% CI: 0,5370,894) p = 0,029. O miR629 foi relacionado à gravidade de acordo com o escore bayesiano no ponto de corte de 0,0009854449, sensibilidade de 66,7%, especificidade de 75% e AUC de 0,729 (IC 95%: 0,5270,897, p = 0,047). Os outros miRNAs, miR15b, miR502 e miR544, não apresentaram resultados significativos. Discussão e Conclusões: Este é o primeiro estudo que analisa o miRNA plasmático como um biomarcador da gravidade da SCA. O miR510 regula a Peroxirredoxina1 (PRDX1), uma proteína envolvida na oxidação do estresse. O aumento do estresse oxidativo apresentado na SCA pode implicar que o miR510 tem um papel nesse mecanismo. O miR629 parece estar envolvido na via de sinalização de AKT1 relacionada à endotelina1. Como é sabido, a endotelina1 está aumentada na AF e é importante na hipertensão pulmonar. Os miR510 e miR629 parecem estar hipoexpressos em pacientes com AF mais grave, provavelmente com maior importância na regulação das manifestações clínicas associadas à doença vascular, embora mais estudos pareçam ser necessários.