Desenvolvimento, caracterização e estudos da autofagia e apoptose em modelo celular de doença de Parkinson
Data
2018-08-30
Autores
Erustes, Adolfo Garcia 
Orientadores
Smaili, Soraya Soubhi
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Parkinson’s disease (PD) is a chronic progressive disease characterized by the death of
dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the brain region. The main
pathological feature of PD is the presence of cytoplasmic protein aggregates called Lewy Bodies,
whose main component is the protein αsynuclein
(αsyn).
It is a protein with functions that remain
poorly understood, however it might act in exocytosis of neurotransmitters vesicles and in
regulation of mitochondrial physiology and morphology. This protein is predominantly found in
wild type (WT) conformation, however mutations in the gene that encodes αsynuclein
(SNCA)
have been described as generating mutant species, such as A30P and A53T, both of which
related to autosomal dominant cases of PD. The accumulation and aggregation of these proteins
in the cytoplasm of neurons may cause mitochondrial dysfunction, cells stress, and cell death.
Transglutaminase2
(TG2) is an enzyme that demonstrates an important role in the generation of
protein aggregates in neurodegenerative diseases and mediates crosslink reactions of proteins.
The aim of this work was to establish a neuronal cellular lineage overexpressing the αsyn
(WT,
A30P and A53T) and verify the occurrence mitochondrial dysfunctions, changes in mitochondrial
membrane potential and Ca2+ homeostasis, as well as the mitochondrial accumulation of these
proteins. For this purpose, western blot analysis, coimmunoprecipitation
assays, as well as real
time, space fluorescence, and confocal microscopy were used. The data showed that αsynucleins
formed aggregates in cellular cytoplasm, mainly in the presence of TG2, and can
mediate this process, by facilitating the oligomerization of these proteins. The aggregates were
partially colocalized
with mitochondria, affecting the mitochondrial membrane potential,
deregulation in homeostasis, and mitochondrial Ca2+ accumulation. An increase in activation of
the mitophagy pathway was also seen in cells overexpressing the mutants asyn
A30P and A53T.
In addition, the overexpression of αsyn
promoted decrease in autophagic activity and the
inhibition of protein degradation that causes accumulation of monomers and oligomers of αsyn.
This data suggests that failures in protein degradation pathways influence the oligomerization and
accumulation of αsyn;
and that TG2, may also have some influence in this process. In addition,
the cytoplasmic accumulation of αsyn
affects mitochondrial physiology, mitochondrial membrane
potential and interferes with Ca2+ homeostasis, especially in the presence of mutated αsyn
A30P
and A53T.
A Doença de Parkinson (DP) é uma doença crônica progressiva, caracterizada pela morte de neurônios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta do cérebro. A principal característica patológica da DP é a presença de agregados proteicos citoplasmáticos, chamados Corpos de Lewy, sendo o principal componente a proteína αsinucleína (αsin). Sua função ainda pouco compreendida, acreditase que atue na exocitose de vesículas de neurotransmissores e na regulação da fisiologia e morfologia mitocondrial. A αsin é comumente encontrada na sua forma selvagem (WT), contudo mutações no gene SNCA, leva a formação de proteínas mutantes, como a A30P e A53T, ambas ligadas a casos autossômicos dominantes da DP. O acúmulo e agregação destas proteínas no citoplasma dos neurônios afetados podem promover estresse celular, disfunções mitocondriais e morte neuronal. A enzima Transglutaminase2 (TG2) demonstra ter papel importante na formação de agregados proteicos em processos neurodegenerativos, uma vez que pode mediar reações de conjugação proteica. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma linhagem celular neuronal superexpressando as αsin (WT, A30P e A53T) e verificar a ocorrência de disfunções mitocondriais, alterações no potencial de membrana mitocondrial e na homeostase do Ca2+, bem como o acúmulo mitocondrial destas proteínas. Além disso, estudar os processos de autofagia e mitofagia nestas linhagens, bem como estas podem mitigar os efeitos citotóxicos promovidos pela superexpressão das αsin, e entender a correlação da αsin e TG2 na formação dos agregados e nas vias de degradação destas proteínas. Para tanto, foram utilizadas técnicas de microscopia de fluorescência em tempo e espaço reais, microscopia confocal, ensaios de coimunoprecipitação e de western blot. Os resultados mostraram que as αsin formaram agregados no citoplasma celular, especialmente na presença da TG2, já que esta pode mediar este processo, favorecendo a oligomerização destas proteínas. Os agregados apresentaram se parcialmente colocalizados com as mitocôndrias, onde afetaram o potencial de membrana mitocondrial, desregulação na homeostase e acúmulo mitocondrial de Ca2+. Houve ainda aumento na sinalização da mitofagia na presença das αsin A30P e A53T. A superexpressão causou a diminuição da atividade autofágica, e a inibição da degradação proteica causa acúmulo de monômeros e oligômeros da αsin. Desta forma, os dados sugerem que falhas nos mecanismos de degradação proteica influenciaram na oligomerização e no acúmulo das αsin; além da TG2, que também pode influenciar neste processo. Além disso, o acúmulo citoplasmático das αsin influenciou na fisiologia mitocondrial, com sensibilização do potencial de membrana mitocondrial, interferência na homeostase do íon Ca2+, inibição da autofagia e aumento nas proteínas sinalizadoras da mitofagia, especialmente na presença das αsin mutantes A30P e A53T.
A Doença de Parkinson (DP) é uma doença crônica progressiva, caracterizada pela morte de neurônios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta do cérebro. A principal característica patológica da DP é a presença de agregados proteicos citoplasmáticos, chamados Corpos de Lewy, sendo o principal componente a proteína αsinucleína (αsin). Sua função ainda pouco compreendida, acreditase que atue na exocitose de vesículas de neurotransmissores e na regulação da fisiologia e morfologia mitocondrial. A αsin é comumente encontrada na sua forma selvagem (WT), contudo mutações no gene SNCA, leva a formação de proteínas mutantes, como a A30P e A53T, ambas ligadas a casos autossômicos dominantes da DP. O acúmulo e agregação destas proteínas no citoplasma dos neurônios afetados podem promover estresse celular, disfunções mitocondriais e morte neuronal. A enzima Transglutaminase2 (TG2) demonstra ter papel importante na formação de agregados proteicos em processos neurodegenerativos, uma vez que pode mediar reações de conjugação proteica. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma linhagem celular neuronal superexpressando as αsin (WT, A30P e A53T) e verificar a ocorrência de disfunções mitocondriais, alterações no potencial de membrana mitocondrial e na homeostase do Ca2+, bem como o acúmulo mitocondrial destas proteínas. Além disso, estudar os processos de autofagia e mitofagia nestas linhagens, bem como estas podem mitigar os efeitos citotóxicos promovidos pela superexpressão das αsin, e entender a correlação da αsin e TG2 na formação dos agregados e nas vias de degradação destas proteínas. Para tanto, foram utilizadas técnicas de microscopia de fluorescência em tempo e espaço reais, microscopia confocal, ensaios de coimunoprecipitação e de western blot. Os resultados mostraram que as αsin formaram agregados no citoplasma celular, especialmente na presença da TG2, já que esta pode mediar este processo, favorecendo a oligomerização destas proteínas. Os agregados apresentaram se parcialmente colocalizados com as mitocôndrias, onde afetaram o potencial de membrana mitocondrial, desregulação na homeostase e acúmulo mitocondrial de Ca2+. Houve ainda aumento na sinalização da mitofagia na presença das αsin A30P e A53T. A superexpressão causou a diminuição da atividade autofágica, e a inibição da degradação proteica causa acúmulo de monômeros e oligômeros da αsin. Desta forma, os dados sugerem que falhas nos mecanismos de degradação proteica influenciaram na oligomerização e no acúmulo das αsin; além da TG2, que também pode influenciar neste processo. Além disso, o acúmulo citoplasmático das αsin influenciou na fisiologia mitocondrial, com sensibilização do potencial de membrana mitocondrial, interferência na homeostase do íon Ca2+, inibição da autofagia e aumento nas proteínas sinalizadoras da mitofagia, especialmente na presença das αsin mutantes A30P e A53T.