Desenvolvimento, caracterização e estudos da autofagia e apoptose em modelo celular de doença de Parkinson

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dc.audience.educationlevelDoutorado
dc.contributor.advisorSmaili, Soraya Soubhi [UNIFESP]pt_BR
dc.contributor.advisorLatteshttp://lattes.cnpq.br/6368730022418127
dc.contributor.authorErustes, Adolfo Garcia [UNIFESP]pt_BR
dc.contributor.authorLatteshttp://lattes.cnpq.br/4111992747501625
dc.contributor.institutionUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)pt_BR
dc.coverage.spatialSão Paulo
dc.date.accessioned2020-03-25T11:43:37Z
dc.date.available2020-03-25T11:43:37Z
dc.date.issued2018-08-30
dc.description.abstractParkinson’s disease (PD) is a chronic progressive disease characterized by the death of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the brain region. The main pathological feature of PD is the presence of cytoplasmic protein aggregates called Lewy Bodies, whose main component is the protein αsynuclein (αsyn). It is a protein with functions that remain poorly understood, however it might act in exocytosis of neurotransmitters vesicles and in regulation of mitochondrial physiology and morphology. This protein is predominantly found in wild type (WT) conformation, however mutations in the gene that encodes αsynuclein (SNCA) have been described as generating mutant species, such as A30P and A53T, both of which related to autosomal dominant cases of PD. The accumulation and aggregation of these proteins in the cytoplasm of neurons may cause mitochondrial dysfunction, cells stress, and cell death. Transglutaminase2 (TG2) is an enzyme that demonstrates an important role in the generation of protein aggregates in neurodegenerative diseases and mediates crosslink reactions of proteins. The aim of this work was to establish a neuronal cellular lineage overexpressing the αsyn (WT, A30P and A53T) and verify the occurrence mitochondrial dysfunctions, changes in mitochondrial membrane potential and Ca2+ homeostasis, as well as the mitochondrial accumulation of these proteins. For this purpose, western blot analysis, coimmunoprecipitation assays, as well as real time, space fluorescence, and confocal microscopy were used. The data showed that αsynucleins formed aggregates in cellular cytoplasm, mainly in the presence of TG2, and can mediate this process, by facilitating the oligomerization of these proteins. The aggregates were partially colocalized with mitochondria, affecting the mitochondrial membrane potential, deregulation in homeostasis, and mitochondrial Ca2+ accumulation. An increase in activation of the mitophagy pathway was also seen in cells overexpressing the mutants asyn A30P and A53T. In addition, the overexpression of αsyn promoted decrease in autophagic activity and the inhibition of protein degradation that causes accumulation of monomers and oligomers of αsyn. This data suggests that failures in protein degradation pathways influence the oligomerization and accumulation of αsyn; and that TG2, may also have some influence in this process. In addition, the cytoplasmic accumulation of αsyn affects mitochondrial physiology, mitochondrial membrane potential and interferes with Ca2+ homeostasis, especially in the presence of mutated αsyn A30P and A53T.en
dc.description.abstractA Doença de Parkinson (DP) é uma doença crônica progressiva, caracterizada pela morte de neurônios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta do cérebro. A principal característica patológica da DP é a presença de agregados proteicos citoplasmáticos, chamados Corpos de Lewy, sendo o principal componente a proteína αsinucleína (αsin). Sua função ainda pouco compreendida, acreditase que atue na exocitose de vesículas de neurotransmissores e na regulação da fisiologia e morfologia mitocondrial. A αsin é comumente encontrada na sua forma selvagem (WT), contudo mutações no gene SNCA, leva a formação de proteínas mutantes, como a A30P e A53T, ambas ligadas a casos autossômicos dominantes da DP. O acúmulo e agregação destas proteínas no citoplasma dos neurônios afetados podem promover estresse celular, disfunções mitocondriais e morte neuronal. A enzima Transglutaminase2 (TG2) demonstra ter papel importante na formação de agregados proteicos em processos neurodegenerativos, uma vez que pode mediar reações de conjugação proteica. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma linhagem celular neuronal superexpressando as αsin (WT, A30P e A53T) e verificar a ocorrência de disfunções mitocondriais, alterações no potencial de membrana mitocondrial e na homeostase do Ca2+, bem como o acúmulo mitocondrial destas proteínas. Além disso, estudar os processos de autofagia e mitofagia nestas linhagens, bem como estas podem mitigar os efeitos citotóxicos promovidos pela superexpressão das αsin, e entender a correlação da αsin e TG2 na formação dos agregados e nas vias de degradação destas proteínas. Para tanto, foram utilizadas técnicas de microscopia de fluorescência em tempo e espaço reais, microscopia confocal, ensaios de coimunoprecipitação e de western blot. Os resultados mostraram que as αsin formaram agregados no citoplasma celular, especialmente na presença da TG2, já que esta pode mediar este processo, favorecendo a oligomerização destas proteínas. Os agregados apresentaram se parcialmente colocalizados com as mitocôndrias, onde afetaram o potencial de membrana mitocondrial, desregulação na homeostase e acúmulo mitocondrial de Ca2+. Houve ainda aumento na sinalização da mitofagia na presença das αsin A30P e A53T. A superexpressão causou a diminuição da atividade autofágica, e a inibição da degradação proteica causa acúmulo de monômeros e oligômeros da αsin. Desta forma, os dados sugerem que falhas nos mecanismos de degradação proteica influenciaram na oligomerização e no acúmulo das αsin; além da TG2, que também pode influenciar neste processo. Além disso, o acúmulo citoplasmático das αsin influenciou na fisiologia mitocondrial, com sensibilização do potencial de membrana mitocondrial, interferência na homeostase do íon Ca2+, inibição da autofagia e aumento nas proteínas sinalizadoras da mitofagia, especialmente na presença das αsin mutantes A30P e A53T.pt_BR
dc.description.sourceDados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2018)
dc.description.sponsorshipFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
dc.description.sponsorshipConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
dc.description.sponsorshipIDFapesp 2013/20.9762
dc.identifierhttps://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=6979336pt_BR
dc.identifier.file2018-0171.pdf
dc.identifier.urihttps://repositorio.unifesp.br/handle/11600/52251
dc.language.isopor
dc.publisherUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.subjectParkinson's Diseaseen
dc.subjectalpha-Synucleinen
dc.subjectMitochondrial dysfunctions, autophagyen
dc.subjectTransglutaminase-2en
dc.subjectDoença de Parkinsonpt_BR
dc.subjectalfa-Sinucleínapt_BR
dc.subjectDisfunções mitocondriaispt_BR
dc.subjectAutofagiapt_BR
dc.subjectTransglutaminase-2pt_BR
dc.titleDesenvolvimento, caracterização e estudos da autofagia e apoptose em modelo celular de doença de Parkinsonpt_BR
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis
unifesp.campusSão Paulo, Escola Paulista de Medicinapt_BR
unifesp.graduateProgramFarmacologiapt_BR
unifesp.knowledgeAreaCiências Biológicaspt_BR
unifesp.researchAreaFarmacologia e Fisiologia Celular e Molecularpt_BR
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