Estratégias de targeting para terapia gênica baseadas em um gene antitumoral
| dc.contributor.advisor | Tavassi, Ana Marisa Chudzinski | |
| dc.contributor.advisorLattes | http://lattes.cnpq.br/6899353560628046 | |
| dc.contributor.author | Cinel, Victor Dal Posolo | |
| dc.contributor.authorLattes | http://lattes.cnpq.br/6845346545995430 | |
| dc.coverage.spatial | São Paulo | |
| dc.date.accessioned | 2025-01-22T13:26:08Z | |
| dc.date.available | 2025-01-22T13:26:08Z | |
| dc.date.issued | 2025-01-17 | |
| dc.description.abstract | Objetivo: Este trabalho teve como objetivo investigar o gene do Amblyomin-X com diferentes targetings intracelulares como um candidato a terapia gênica antitumoral. Neste estudo foi avaliado o impacto da expressão e direcionamento do Amblyomin X, uma molécula antitumoral derivada de uma biblioteca de cDNA da glândula salivar do carrapato Amblyomma sculptum, para diferentes compartimentos subcelulares e os possíveis efeitos citotóxicos, com foco em melanoma humano. Métodos: Foram desenvolvidos plasmídeos para expressar o Amblyomin-X em células humanas e direcioná-lo para diferentes destinos: secreção; translocação e retenção no retículo endoplasmático; translocação para as mitocôndrias; e uma construção para a produção do Amblyomin X sem endereçamento específico. A expressão do Amblyomin-X foi avaliada em células de melanoma SK-MEL-28 e em células não tumorais HEK-293T. Para avaliar a produção da proteína, foram utilizadas as técnicas de RT-qPCR, Western Blot e espectrometria de massas. Para avaliação do potencial citotóxico, foram realizados os ensaios de MTT, detecção de atividade de caspases 3/7 e avaliação de morte celular por citometria de fluxo. Mutações sítio-dirigidas em lisinas foram realizadas para tentar estabilizar o Amblyomin X intracelular, e o inibidor do proteassoma comercial MG132 foi utilizado para investigar o mecanismo de degradação do Amblyomin X. Além disso, foram realizadas tentativas de adaptar células HEK-293 para cultivo em meios com baixa concentração de FBS para viabilizar a purificação e avaliação do Amblyomin X secretado. Resultados: Embora todas as formas do Amblyomin X tenham sido detectadas em células HEK-293T, apenas as formas endereçadas para o retículo endoplasmático e secretadas foram identificadas em células SK-MEL-28. Não foi observado efeito citotóxico do Amblyomin X em nenhuma das duas linhagens celulares. Além disso, nas células tumorais de melanoma, foi identificada a degradação do Amblyomin X sem endereçamento e do Amblyomin X mitocondrial via ação do proteassoma. As mutações sitio-dirigidas não foram capazes de estabilizar o Amblyomin X intracelular, e os ensaios de inibição do proteassoma indicam que essas formas do Amblyomin X são degradadas de maneira independente de ubiquitinação e SUMOilação. A adaptação das células HEK-293T para meio sem FBS foi ineficaz, e a redução de FBS levou à parada da expressão do Amblyomin X secretado. Conclusões: O estudo indicou que a expressão do Amblyomin X diretamente nas células humanas enfrenta desafios, como a degradação proteassomal em células tumorais e a ausência de atividade antitumoral. Estudos para desvendar em detalhes a interação do Amblyomin X com o proteassoma são necessários para o desenvolvimento eficiente de uma terapia gênica antitumoral com o gene do Amblyomin X. | |
| dc.description.abstract | Objective: This work aimed to investigate the Amblyomin-X gene with different intracellular targetings as a candidate for antitumor gene therapy. The study evaluated the impact of the expression and targeting of Amblyomin X, an antitumor molecule derived from a cDNA library of the salivary gland of the tick Amblyomma sculptum, to different subcellular compartments and its potential cytotoxic effects, with a focus on human melanoma. Methods: Plasmids were developed to express Amblyomin X in human cells and target it to different destinations: secretion; translocation and retention in the endoplasmic reticulum; translocation to mitochondria; and a construct for the production of Amblyomin X without specific targeting. Amblyomin X expression was evaluated in SK-MEL-28 melanoma cells and in non-tumor HEK-293T cells. To evaluate protein production, RT-qPCR, Western Blot and mass spectrometry techniques were used. To evaluate the cytotoxic potential, MTT assays, detection of caspase 3/7 activity and evaluation of cell death by flow cytometry were performed. Site-directed mutations in lysines were performed to try to stabilize intracellular Amblyomin X, and the commercial proteasome inhibitor MG132 was used to investigate the mechanism of Amblyomin X degradation. In addition, attempts were made to adapt HEK-293 cells to culture in media with low FBS concentration to enable purification and evaluation of secreted Amblyomin X. Results: Although all forms of Amblyomin X were detected in HEK-293T cells, only the endoplasmic reticulum-bound and secreted forms were identified in SK-MEL-28 cells. No cytotoxic effect of Amblyomin X was observed in either cell line. Furthermore, in melanoma tumor cells, proteasome degradation of Amblyomin X without specific targeting and mitochondrial Amblyomin X was identified. Site-directed mutations were unable to stabilize intracellular Amblyomin X, and proteasome inhibition assays showed that these forms of Amblyomin X are degraded in a manner independent of ubiquitination and SUMOylation. Adaptation of HEK-293T cells to medium without FBS was ineffective, and reduction of FBS led to the cessation of expression of secreted Amblyomin X. Conclusions: The study indicated that direct expression of Amblyomin X in human cells faces challenges, such as proteasomal degradation in tumor cells and the absence of antitumor activity. Studies to unravel in detail the interaction of Amblyomin X with the proteasome are necessary for the efficient development of an antitumor gene therapy with the AMB gene. | |
| dc.description.sponsorship | Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) | |
| dc.emailadvisor.custom | ana.chudzinski@butantan.gov.br | |
| dc.format.extent | 108 f. | |
| dc.identifier.citation | CINEL, Victor Dal Posolo. Estratégias de targeting para terapia gênica baseadas em um gene antitumoral. 2024. 108 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas: Biologia Molecular) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2024. | |
| dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/11600/72809 | |
| dc.language | por | |
| dc.publisher | Universidade Federal de São Paulo | |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | |
| dc.subject | Terapia Gênica | |
| dc.subject | Câncer | |
| dc.subject | Kunitz | |
| dc.subject.ods | 3. Saúde e bem-estar | |
| dc.title | Estratégias de targeting para terapia gênica baseadas em um gene antitumoral | |
| dc.title.alternative | Gene therapy targeting strategies based on an antitumoral gene | |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | |
| unifesp.campus | Escola Paulista de Medicina (EPM) | |
| unifesp.graduateProgram | Ciências Biológicas (Biologia Molecular) | |
| unifesp.knowledgeArea | Biologia Molecular | |
| unifesp.researchArea | Terapia Gênica para Câncer |