PPG - Ciências Biológicas (Biologia Molecular)

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    Acesso aberto (Open Access)
    Caracterização biofísica de vesículas catiônicas de DODAB contendo α-galactosilceramida (α-galcer) e lisofosfatidilcolinas (LPC 18:1 e LPC 18:0)
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-06-28) Martins, Leticia de Souza [UNIFESP]; Rozenfeld, Julio Henrique Kravcuks [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4232139220639334
    Objetivo: Caracterizar a estrutura e as propriedades térmicas de arranjos supramoleculares formados entre o lipídio catiônico brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) e frações molares de lipídios que apresentam atividade agonista sobre as células CD1d-restritas, tais como α-galactosilceramida (α-GalCer) ou lisofosfatidilcolina 18:1 (LPC 18:1), e comparar os efeitos de LPC18:1 e 18:0 no contexto desses arranjos supramoleculares. Métodos: Foram preparadas dispersões coloidais em tampão HEPES (10 mM, pH 7,4) a partir da hidratação de filmes lipídicos contendo DODAB, LPC18:0, LPC18:1, α-GalCer, ou misturas de DODAB e demais lipídios. Essas dispersões foram caracterizadas por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) e por Espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR). Resultados: α-GalCer diminui a temperatura e a cooperatividade de transição de fase das vesículas de DODAB, bem como o empacotamento da fase gel de DODAB. Já a fase fluida de DODAB é enrijecida na presença de α-GalCer. Com relação às lisofosfatidilcolinas, foi observado que o LPC18:1 diminui a cooperatividade e a temperatura de transição gel-fluida de DODAB, enquanto LPC18:0 aumenta a entalpia dessa transição. Também foi observada a coexistência de duas populações com rigidez diferente na presença de LPC18:1 na fase gel de DODAB, que se torna mais enrijecida na presença de LPC18:0. Na fase fluida, LPC18:1 induz um aumento de rigidez da superfície das vesículas de DODAB, enquanto LPC18:0 aumenta a rigidez tanto na superfície quanto no centro das bicamadas que formam estas vesículas. Conclusão: Os efeitos observados em misturas de DODAB com α-GalCer são, provavelmente, resultantes da conformação da ligação amida rígida que conecta a fitoesfingosina e a cadeia de acila longa e saturada de α-GalCer. Já a diferença de uma única ligação dupla tipo cis entre LPC18:0 e LPC18:1 teve um impacto significativo nos efeitos dessas lisofosfatidilcolinas sobre as propriedades termotrópicas e a estrutura das vesículas de DO-DAB. A caracterização biofísica destes arranjos supramoleculares é fundamental para planejar e desenvolver novas aplicações biotecnológicas que envolvem o uso dessas vesículas mistas de DODAB.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Avaliação da expressão de ligninases de actinobactérias provenientes de biomas brasileiros
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-06-20) Gutierres, Fernanda Camila [UNIFESP]; Chagas, Jair Ribeiro [UNIFESP]; Vasconcellos, Suzan Pantaroto [UNIFESP]; https://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761991D9&tokenCaptchar=03AFcWeA4fsPbcVabwfxDWnITxjZ7sJ1T8C3_RLkHyPcHI1rUpmR47o2sXKD9ruX7J5vYIvsTy7fBt7ZIbL56gzT_pjVwRhKwIRVGw312pbU4RN6JF1GqmN0zWblfzRq_zDlbLa0BzQqrzpINjtCVukVPw4X5el_3M4oNtqfQKWmmgi2nDlL7GyJX_tfb6bnkuXFgwppp6F2M0EoVbpuex1EZVZhJ7eeM4UujabOxj1IhT8rRQYXZvgfWG7ksTQRNvzmP5xkB9q8kSDJtxxlpIwicgqHrQfVdCRyhkP0rfi7rtSUTM-PuRX6wyjffT45D8BZbA97aFX0ik5l3N9zCYb1fK4hPdW2QmCFozaeOE0A7oxO5PFvSRdlkMisX8ibw9MXJr6MJtscKFgbF83duIMWqfo08gUnNQ82NpbO9LHvMOop_Auh8MKMJizrqAaQ-hTYpzTubTiEgLmraS4ofM0X2odsFpYXNHcaQoYZyxIMj95j9oMcSfz71Dj8Ir2AejsqqjwRn6p-Lan4c20vgZlXY6Z6xfN2LobJVddvMddRNRZItwsHV-eh02NEXRcexUDXncZOVUFL9zKR3ngY2qGIinjg8l9RxT5gNwv9tAOTlNZPUFh8_UPbcFUQ9obz7fhgNbGTMonOl9_5OQl2KU7CBjGNQd_qBLPFaVWMLoMhBdzJOl2WZHocvXrwG1NfRM22RuA_0f8JlhldQECJy3xXjYsPlsExfn8dhSDby_uzKEWsKT76Quwa0; https://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790181H2&tokenCaptchar=03AFcWeA5PSh8UKSlg0Gz8Hk7YhgkSSGKiP03_Q28Rm1gTpJWF08WKkXfazejjZVc7Uq_-Vu7aXH7okOPPK8MGehx1N_NNXGLzeCbVtJTLHRSoK7m5F9h9IoJFYnVnykNK72H7USIxET9swI0iEW9F4o2sE38HTT9c2gN3ifEOQ3Pv3n0WpzqUpuqnzt21cTNUX8ZoiGAelB9AkT2F5NTNurXq2KVpOEeFIeg997tNkG91rPPlN-roBFWiBgfM2ehWJjP0htcLrN4m3peQywizvkUY2cyl5bvTN8JjBFErLg_CUiVb87dnp2wStpKuf5rzXRB4OfHJm6hT9nehdt03I5rIPaFj4VMcoaXo_VPFupVan6mG_U7VG8_6NR1i0PDswh1AVxVpASm61M4m9EOXEWGanV9GuRQNKaqdRqZpovbCFpkNl1z-AFNtxn5V9rgPuXrD-1BX1OsPq3vHysL9IZE8uiKMrfoXBZovq6Nt5IwviNLIaGV-rvbx1b-hAFevNqRVnRHuZUbBn_i0_c48OzTuodOf66jMxQRKlSC5YIE8DinMsLNHfOr-oTXevcAnqxjKpfPQjBkuYB0ZQ3Gl2fIb-OG2VCldBDeFLS_BuCDXiDRhOKNBCRnCh-bqXfpnbu9OEzpes2E6XcYMxBK5j4cH8E1ovt36fYJT_ZKTGmx_jfXgX1aSV8wORrntVJSGJMiB9aa9vJoz07MXMJ7-aBNA-0ybHPOfae4naOBe9cQChtghIQZNRuk
    As actinobactérias são bactérias conhecidas por suas habilidades em produzir muitos compostos bioativos, incluindo enzimas com múltiplas aplicações industriais e são encontradas em vários biomas brasileiros. Esse estudo teve como objetivo avaliar a produção de enzimas lignocelulolíticas como lignina peroxidase e lacase presentes no meio extracelular das culturas de actinobactérias isoladas de amostras de solo e rizosfera coletadas na Caatinga, Mata Atlântica e Floresta Amazônica. Essas enzimas desempenham um papel essencial na decomposição da lignina, através da oxidação de compostos fenólicos e não fenólicos, bem como na hidrólise enzimática da biomassa vegetal. Nesse sentido, um total de 173 actinobactérias foram investigadas em ensaios miniaturizados. Dez actinobactérias foram selecionadas para caracterização bioquímica. A actinobactéria AC 166 apresentou atividade de Lacase (1,8 U/L) e Lignina peroxidase (78 U/L). Para essas atividades foram avaliadas a termoestabilidade (4, 30 e 60 °C), o efeito de salinidade (0 a 4 M) e o efeito de variações de pH (2,0 a 9,0) dos extratos brutos contendo Lignina peroxidase (EC 1.11.1.14) e Lacase (EC 1.10.3.2). As atividades se mostraram estáveis com relação a todos os parâmetros. Paralelo a esses ensaios, foram analisados os Líquidos Iônicos e diferentes Misturas Eutéticas como agentes solvatantes para avaliar a biodisponibilidade dos substratos lignocelulósicos. Entre 0,01% e 2% esses solvatantes apresentaram pouca ou nenhuma toxicidade. A atividade da Lignina peroxidase na amostra AC 16 em duas Misturas Eutéticas, foi de 10,8 U/L e 15,2 U/L , AC 22: 9,9 U/L e 15,3, AC 76: 11,7 e 5,9 e AC 166: 10,1 e 11,6 U/L. Liquidos Iônicos e Misturas Eutéticas podem ser consideradas alternativas viáveis como solventes e co-solventes, uma vez que solubilizam a lignina e apresentam inúmeras vantagens ambientais. Com isso, as actinobactérias isoladas de biomas brasileiros exibiram potencial biotecnológico em relação às enzimas ligninolíticas para a degradação de materiais lignocelulósicos, mostrando perfis promissores para uma futura aplicação em biomassa lignocelulósica em biorrefinarias de bioetanol.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Alteração da homeostase no sistema linfo-hematopoético em animais P2X7-/- e seus efeitos nos processos de proliferação e diferenciação
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-03-22) Souza, Kamylla Fernanda Souza de [UNIFESP]; Paredes-Gamero, Edgar Julian [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9562213378846769; http://lattes.cnpq.br/6749612870641449
    As células-tronco hematopoéticas (CTH) têm o potencial de gerar todas as células do sistema linfo-hematopoético. Compreender seus mecanismos de auto-renovação, expansão e diferenciação, durante a hematopoese, tem grande relevância científica e clínica. Alguns moduladores, como o ATP e os receptores purinérgicos, têm sido estudados para compreender sua atuação nos nichos hematopoéticos, onde podem atuar na regulação e manutenção das CTH e células progenitoras. O receptor purinérgico P2X7 (P2X7R) é um receptor do tipo canal catiônico, que tem o ATP como seu principal agonista fisiológico, cuja atividade tem sido principalmente associada ao sistema imunológico, com poucos estudos mostrando sua participação na hematopoese. Neste estudo foram utilizados camundongos C57BL/6 wild type (WT) e nocaute para o P2X7R (P2X7-/-), para investigar a relevância e a função deste receptor na modulação das CTH e seus efeitos na diferenciação mieloide e linfoide. Ao avaliar a expressão do P2X7R nas células hematopoéticas extraídas da medula óssea, observou-se que o P2X7R é mais expresso nas células primitivas em contexto normal e após sepse. A imunofenotipagem das populações hematopoéticas da medula óssea e do baço mostrou um aumento do número de CTH e de células progenitoras mieloide e linfoide em animais P2X7-/-. A redução de eritrócitos na medula óssea destes animais foi compensada com o aumento desta população no baço e os parâmetros hematológicos não foram alterados. Também não houve alteração na capacidade das células hematopoéticas e progenitoras da medula óssea de formar colônias. Escolheu-se a indução de sepse pelo método de punção e ligadura cecal (CLP) para promover uma resposta inflamatória e modular o sistema linfo-hematopoético. O estímulo inflamatório induziu na medula óssea dos animais WT o aumento de CTH, c-Kit+, progenitores de granulócitos e granulócitos maduros, em contrapartida ao menor número de neutrófilos no sangue periférico. Os animais P2X7-/- apresentaram resposta contrária, com aumento do número de neutrófilos periféricos e redução de CTH e de todos os progenitores na MO. Tanto em animais WT quanto em P2X7-/- a eritropoese foi reduzida e houve menor expressão dos fatores de transcrição NF-E2, Gata-1, na MO. Em animais P2X7-/-, a indução de CLP levou ao aumento da formação de colônias hematopoéticas, especialmente de unidades formadoras de colônias de monócitos, mas no sangue periférico essas células estavam em menor número. Ademais, foram avaliados outros marcadores relacionados à hematopoese e inflamação como espécies reativas de oxigênio (EROs), citocinas pró e anti-inflamatórias, e imunoglobulinas. Animais P2X7-/- sépticos apresentaram altos níveis de EROs na cavidade peritoneal e medula óssea, mas não no plasma, onde houve aumento de interleucina-6 e imunoglobulina M. Em conjunto, nossos resultados destacam uma complexa interação do P2X7R com influência em diferentes aspectos da homeostase hematopoética e na dinâmica de proliferação e diferenciação em modelo inflamatório, abrindo caminho para futuras pesquisas e aplicações clínicas potenciais.
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    Embargo
    Construção de bibliotecas de inibidores de serinoproteases em sistema phage display: seleção de inibidores para enzimas de Flavivírus e do mosquito Aedes aegypti
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-02-09) Manzato, Verônica de Moraes [UNIFESP]; Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]; Torquato, Ricardo José Soares [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3995278540776284; http://lattes.cnpq.br/1168789309568199; http://lattes.cnpq.br/3139881734780671
    Introdução: No Brasil, ocorrem, de forma endêmica, arboviroses como Dengue, Zika, Chikungunya e Febre amarela, que possuem um vetor comum, o mosquito Aedes aegypti. As enzimas NS2B-NS3 dos flavivírus e as tripsinas nos Aedes aegypti desempenham funções essenciais no ciclo viral e na digestão de Aedes spp, respectivamente, o que justifica a busca por inibidores dessas enzimas como opções para romper esses ciclos. Nesse contexto, a técnica phage display tem sido uma aliada. Os inibidores Boophilina domínio 1 (D1) e Sunflower trypsin inhibitor (SFTI), são representantes das famílias de inibidores Kunitz-BPTI (I2) e sunflower cyclic trypsin inhibitor (família I12), respectivamente, e inibem serinoproteases na ordem de nano molar. Objetivo: Selecionar através da técnica de phage display, inibidores das bibliotecas BoophilinaD1 e SFTI, com a utilização de 3 alvos (proteases ZIKV, DENV2 e tripsina5607). Seguido pela caracterização cinética e in silico dos mutantes mais frequentes. Métodos: As proteases DENV2Pro e tripsina5607, foram expressas em bactéria E coli SHuffleT7 e purificadas por afinidade. As bibliotecas de inibidores foram sintetizadas utilizando técnicas moleculares de PCR, utilizando-se o plasmídeo pCANTAB5E e bactérias E. coli TG1. As seleções foram realizadas para enzimas do vírus ZIKVPro, DENV2Pro e do mosquito vetor tripsina5607. Os mutantes de BoophilinaD1 mais frequentes, selecionados para a enzima do ZIKVPro foram produzidos e utilizados nos ensaios cinéticos para determinação do perfil inibitório para as enzimas (ZIKVPro e DENV2Pro), utilizados também na modelagem, docking molecular e refinamento para as enzimas de flavivírus, via MODELLER, ClusPro e RosettaDock, respectivamente. Resultados: As enzimas alvo purificadas apresentaram bandas predominantes e ativas em torno de 28 e 26 kDa, para DENV2Pro e tripsina5607, respectivamente. A ZIKVPro usada nas seleções foi gentilmente cedida por Dr. Martin Wurtele. Os títulos das bibliotecas utilizadas nos processos de seleção foram de 2,9 x 106 CFU e 2,1 x 105 CFU para BoophilinaD1 e SFTI, respectivamente. Dentre os inibidores BophD1 mut selecionados, 76,5% apresentam aminoácido básico Arg ou Lys na posição P1 e 70,6% e 58,8% Ala na posição P1’e P4’, respectivamente. O inibidor BoophD1 WT e os BoophD1 mut12 e mut14 apresentam Ki entre 1 e 2 nM para tripsina bovina e aproximadamente 100 e 300 nM para as enzimas ZIKVPro e DENV2Pro, respectivamente. As análises in silico de docking molecular indicam diferenças de interação dos mutantes com as enzimas. Os mutantes da biblioteca SFTI selecionados para os três alvos são, em sua maioria, compartilhados e sem consenso. Subtraindo-se os ligantes inespecíficos, destaca-se as sequências (P1-P4’) ARQLL, KSQWD e LSRHP por serem representativas para ZIKVPro, DENV2Pro e tripsina5607, respectivamente. Esses SFTIs mutantes foram sintetizados e serão utilizados futuramente nos ensaios cinéticos para caracterização inibitória com diferentes alvos. Discussão: As enzimas proteolíticas desempenham papéis importantes em diversas funções, no caso das DENV2Pro e ZIKVPro, estão relacionadas com a clivagem da poliproteína e no caso da tripsina5607, relacionada a digestão de proteínas ingeridas pela larva de Ae. aegypti. Obtê-las de forma recombinante, solúvel e ativa é importante para aprofundar nossos conhecimentos sobre elas e fornecem informações para o desenvolvimento de inibidores com alta afinidade, podendo ser um inibidor específico ou pan-inibidores (para diferentes flavivírus). Conclusão: Este trabalho traz dados importantes sobre a busca de inibidores para as proteases de flavivírus e de mosquito utilizando bibliotecas de inibidores em sistema phage display. Inibidores para ZIKVPro foram selecionados por phage display e apresentaram constantes de inibição em 10-7 M assim como para a DENV2Pro, estes resultados sugerem que os inibidores selecionados são candidatos a pan-inibidores para proteases de flavivírus.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Expressão e purificação do domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína Spike do vírus SARS-Cov-2 da cepa de Wuhan
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-04-03) Vaz, Fábio Antonio Busoli [UNIFESP]; Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1168789309568199; http://lattes.cnpq.br/0752962071052417
    Objetivos: O objetivo foi a obtenção da RBD de SARS-CoV-2 e realizar estudos de expressão, solubilização e purificação da RBD-wt recombinante a fim de encontrar uma condição ótima. Métodos: A construção plasmidial contendo a RBD-wt utilizada para obtenção da variante P1 por meio da estratégia de mutação sítio-dirigida por reações de PCR. O fragmento de DNA foi purificado e inserido no vetor pRSET-A. O DNA plasmidial da construção contendo a RBD-wt foi utilizado na transformação de células BL21(DE3) pLysS competentes, por choque térmico e, após a confirmação dos clones positivos, foram feitos os testes de expressão a fim de otimizar a produção da RBD-wt recombinante. Após os testes de expressão, foi realizado um teste de solubilidade e foi feita a detecção da RBD-wt por Western Blot. Após esses testes, foi feita a purificação da RBD-wt usando dois métodos diferentes de expressão para obter a proteína recombinante. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade. Resultados: Bactérias transformadas com plasmídeos contendo a sequência da RBD-wt foram confirmadas por PCR de colônia. Os clones positivos foram utilizados para a expressão da proteína recombinante que foi confirmada por SDS-PAGE apresentando uma banda proteica de aproximadamente 32 kDa. Um clone positivo foi utilizado para os testes de expressão, sob diferentes concentrações do agente indutor, tempos de incubação e temperaturas. Os resultados mostraram que as concentrações testadas do indutor não afetaram a expressão da proteína. Contudo, o tempo de incubação e a temperatura afetaram os níveis de expressão. As melhores condições observadas para a expressão de RBD-wt foram utilizando o meio de autoindução. A proteína RBD-wt recombinante foi obtida majoritariamente na forma insolúvel, dados confirmados por SDS-PAGE e Western Blotting. A proteína recombinante foi solubilizada em 8 M de ureia e purificada por cromatografia de afinidade em coluna His-Sepharose, sendo realizado o refolding dentro da coluna. Desta forma, a proteína solúvel foi obtida na eluição. A construção plasmidial contendo a sequência da RBD-P1 foi obtida com sucesso utilizando mutação sítio-dirigida e a sequência da RBD-wt como DNA-molde. A sequência correta foi confirmada por sequenciamento DNA. Conclusão: Dentre as condições testadas para a expressão da RBD-wt, não foi observado uma condição que aumentasse o rendimento da proteína recombinante solúvel quando comparada com as condições de solubilização e refolding publicadas anteriormente. Neste trabalho foi possível obter a construção plasmidial contendo a sequência de RBD-P1, que poderá ser utilizada em estudos futuros.