PPG - Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
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- ItemConstrução de bibliotecas de inibidores de serinoproteases em sistema phage display: seleção de inibidores para enzimas de Flavivírus e do mosquito Aedes aegypti(Universidade Federal de São Paulo, 2023-02-09) Manzato, Verônica de Moraes [UNIFESP]; Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]; Torquato, Ricardo José Soares [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3995278540776284; http://lattes.cnpq.br/1168789309568199; http://lattes.cnpq.br/3139881734780671Introdução: No Brasil, ocorrem, de forma endêmica, arboviroses como Dengue, Zika, Chikungunya e Febre amarela, que possuem um vetor comum, o mosquito Aedes aegypti. As enzimas NS2B-NS3 dos flavivírus e as tripsinas nos Aedes aegypti desempenham funções essenciais no ciclo viral e na digestão de Aedes spp, respectivamente, o que justifica a busca por inibidores dessas enzimas como opções para romper esses ciclos. Nesse contexto, a técnica phage display tem sido uma aliada. Os inibidores Boophilina domínio 1 (D1) e Sunflower trypsin inhibitor (SFTI), são representantes das famílias de inibidores Kunitz-BPTI (I2) e sunflower cyclic trypsin inhibitor (família I12), respectivamente, e inibem serinoproteases na ordem de nano molar. Objetivo: Selecionar através da técnica de phage display, inibidores das bibliotecas BoophilinaD1 e SFTI, com a utilização de 3 alvos (proteases ZIKV, DENV2 e tripsina5607). Seguido pela caracterização cinética e in silico dos mutantes mais frequentes. Métodos: As proteases DENV2Pro e tripsina5607, foram expressas em bactéria E coli SHuffleT7 e purificadas por afinidade. As bibliotecas de inibidores foram sintetizadas utilizando técnicas moleculares de PCR, utilizando-se o plasmídeo pCANTAB5E e bactérias E. coli TG1. As seleções foram realizadas para enzimas do vírus ZIKVPro, DENV2Pro e do mosquito vetor tripsina5607. Os mutantes de BoophilinaD1 mais frequentes, selecionados para a enzima do ZIKVPro foram produzidos e utilizados nos ensaios cinéticos para determinação do perfil inibitório para as enzimas (ZIKVPro e DENV2Pro), utilizados também na modelagem, docking molecular e refinamento para as enzimas de flavivírus, via MODELLER, ClusPro e RosettaDock, respectivamente. Resultados: As enzimas alvo purificadas apresentaram bandas predominantes e ativas em torno de 28 e 26 kDa, para DENV2Pro e tripsina5607, respectivamente. A ZIKVPro usada nas seleções foi gentilmente cedida por Dr. Martin Wurtele. Os títulos das bibliotecas utilizadas nos processos de seleção foram de 2,9 x 106 CFU e 2,1 x 105 CFU para BoophilinaD1 e SFTI, respectivamente. Dentre os inibidores BophD1 mut selecionados, 76,5% apresentam aminoácido básico Arg ou Lys na posição P1 e 70,6% e 58,8% Ala na posição P1’e P4’, respectivamente. O inibidor BoophD1 WT e os BoophD1 mut12 e mut14 apresentam Ki entre 1 e 2 nM para tripsina bovina e aproximadamente 100 e 300 nM para as enzimas ZIKVPro e DENV2Pro, respectivamente. As análises in silico de docking molecular indicam diferenças de interação dos mutantes com as enzimas. Os mutantes da biblioteca SFTI selecionados para os três alvos são, em sua maioria, compartilhados e sem consenso. Subtraindo-se os ligantes inespecíficos, destaca-se as sequências (P1-P4’) ARQLL, KSQWD e LSRHP por serem representativas para ZIKVPro, DENV2Pro e tripsina5607, respectivamente. Esses SFTIs mutantes foram sintetizados e serão utilizados futuramente nos ensaios cinéticos para caracterização inibitória com diferentes alvos. Discussão: As enzimas proteolíticas desempenham papéis importantes em diversas funções, no caso das DENV2Pro e ZIKVPro, estão relacionadas com a clivagem da poliproteína e no caso da tripsina5607, relacionada a digestão de proteínas ingeridas pela larva de Ae. aegypti. Obtê-las de forma recombinante, solúvel e ativa é importante para aprofundar nossos conhecimentos sobre elas e fornecem informações para o desenvolvimento de inibidores com alta afinidade, podendo ser um inibidor específico ou pan-inibidores (para diferentes flavivírus). Conclusão: Este trabalho traz dados importantes sobre a busca de inibidores para as proteases de flavivírus e de mosquito utilizando bibliotecas de inibidores em sistema phage display. Inibidores para ZIKVPro foram selecionados por phage display e apresentaram constantes de inibição em 10-7 M assim como para a DENV2Pro, estes resultados sugerem que os inibidores selecionados são candidatos a pan-inibidores para proteases de flavivírus.
- ItemExpressão e purificação do domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína Spike do vírus SARS-Cov-2 da cepa de Wuhan(Universidade Federal de São Paulo, 2024-04-03) Vaz, Fábio Antonio Busoli [UNIFESP]; Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1168789309568199; http://lattes.cnpq.br/0752962071052417Objetivos: O objetivo foi a obtenção da RBD de SARS-CoV-2 e realizar estudos de expressão, solubilização e purificação da RBD-wt recombinante a fim de encontrar uma condição ótima. Métodos: A construção plasmidial contendo a RBD-wt utilizada para obtenção da variante P1 por meio da estratégia de mutação sítio-dirigida por reações de PCR. O fragmento de DNA foi purificado e inserido no vetor pRSET-A. O DNA plasmidial da construção contendo a RBD-wt foi utilizado na transformação de células BL21(DE3) pLysS competentes, por choque térmico e, após a confirmação dos clones positivos, foram feitos os testes de expressão a fim de otimizar a produção da RBD-wt recombinante. Após os testes de expressão, foi realizado um teste de solubilidade e foi feita a detecção da RBD-wt por Western Blot. Após esses testes, foi feita a purificação da RBD-wt usando dois métodos diferentes de expressão para obter a proteína recombinante. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade. Resultados: Bactérias transformadas com plasmídeos contendo a sequência da RBD-wt foram confirmadas por PCR de colônia. Os clones positivos foram utilizados para a expressão da proteína recombinante que foi confirmada por SDS-PAGE apresentando uma banda proteica de aproximadamente 32 kDa. Um clone positivo foi utilizado para os testes de expressão, sob diferentes concentrações do agente indutor, tempos de incubação e temperaturas. Os resultados mostraram que as concentrações testadas do indutor não afetaram a expressão da proteína. Contudo, o tempo de incubação e a temperatura afetaram os níveis de expressão. As melhores condições observadas para a expressão de RBD-wt foram utilizando o meio de autoindução. A proteína RBD-wt recombinante foi obtida majoritariamente na forma insolúvel, dados confirmados por SDS-PAGE e Western Blotting. A proteína recombinante foi solubilizada em 8 M de ureia e purificada por cromatografia de afinidade em coluna His-Sepharose, sendo realizado o refolding dentro da coluna. Desta forma, a proteína solúvel foi obtida na eluição. A construção plasmidial contendo a sequência da RBD-P1 foi obtida com sucesso utilizando mutação sítio-dirigida e a sequência da RBD-wt como DNA-molde. A sequência correta foi confirmada por sequenciamento DNA. Conclusão: Dentre as condições testadas para a expressão da RBD-wt, não foi observado uma condição que aumentasse o rendimento da proteína recombinante solúvel quando comparada com as condições de solubilização e refolding publicadas anteriormente. Neste trabalho foi possível obter a construção plasmidial contendo a sequência de RBD-P1, que poderá ser utilizada em estudos futuros.
- ItemCharacterization of astrocyte subpopulations after hypoxia in vitro(Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-13) Courbassier, Natália Rodrigues [UNIFESP]; Porcionatto, Marimélia Aparecida [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6155537170968904; http://lattes.cnpq.br/2039026333783706Astrocytes become reactive after a Central Nervous System (CNS) injury, passing by phenotypic changes (mainly hypertrophy and gene expression modifications), which can include proliferation and dedifferentiation. Physiologically, astrocytes are very heterogenous cells, they can vary according to region, layer location, morphology, age,and others. Given their heterogeneity, a growing body of literature has been sought to unravel astrocytespecific functions and signatures. Such heterogeneity extends to their reactive state, which is not a uniform response but rather possesses high complexity varying according to stimulus nature and intensity. Previously, our Lab described Notch signaling activation on astrocyte reactivity in vivo and in vitro of brain damage by traumatic brain injury. In addition, we studied the influence of several biomaterials' stiffness on astrocyte reactivity and their morphological response in vitro. In both studies reactive astrocytes showed an aggregation pattern characterized by nonhomogeneous distribution at culture dish. Here, we sought to evaluate whether hypoxia would promote astrocyte reactivity and induce their aggregation in vitro. Further, we characterized astrocyte subpopulation profiles considering their maturity state and expression of reactive protein markers. The brain is one of the most sensitive organs to hypoxia due to its high energy supply required to maintain its proper function. Hypoxia/ischemia have been extensively used as an experimental target in a wide range of studies. However, there is a lack of hypoxia outcome itself, a condition observed in perinatal hypoxia. Here, we observed morphological changes after hypoxia. However, gene expression of the main reactivity markers of astrocytes remained unaltered. For the first time we described an astrocytes aggregation pattern in vitro in response to hypoxia. The molecular and cellular characterization of astrocytes in physiological and pathological conditions can provide higher comprehension about their role in health and disease, such knowledge can uncover mechanisms that underlies its response to achieve regenerative medicine advances.
- ItemInvestigation of NR2F2/COUP-TFII function during early gonadal development in humans and analysis of new genetic variants in individuals with SRY-negative 46,XX testicular/ovotesticular difference/disorder of sex development (DSD)(Universidade Federal de São Paulo, 2024-04-23) Ferreira, Lucas Garcia Alves [UNIFESP]; Silva, Magnus Régios Dias da [UNIFESP]; Ayers, Katie; Sinclair, Andrew; http://lattes.cnpq.br/2598816440086436; http://lattes.cnpq.br/2251799531659813Human gonadal development is established by balancing mutually antagonistic sex signaling networks. The pro-testicular pathway is triggered by SRY gene activation. Evi-dence has suggested the existence of a genetic module probably composed of more than one factor acting as the trigger for the pro-ovarian pathway. However, factors directing ovarian development are poorly understood, especially due to insufficient studies using appropriate models to investigate human ovary differentiation. The disruption of these signaling pathways may lead to differences/diversities/disorders of sex development (DSD), such as 46,XX testicular/ovotesticular DSD (46,XX T/OT-DSD). The SRY gene translocation explains part of 46,XX T/OT-DSD cases; however, many SRY-negative cases remain without molecular diagnosis. In recent years, genetic variants in NR2F2 (nuclear receptor subfamily 2 group F member 2), encoding the transcription factor COUP-TFII (chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 2), have been reported as novel causes of SRY-negative 46,XX T/OT-DSD. Our research team de-scribed a 3-Mb deletion containing NR2F2 in an individual with SRY-negative 46,XX OT-DSD, atypical male external genitalia, cardiac defects, and dysmorphic facial features. However, the genetic network regulated by COUP-TFII in human gonadal somatic cells is unknown. We aimed to investigate the mechanisms underlying the development of tes-ticular tissue in 46,XX individuals with loss-of-function variants in NR2F2 and to search for new genetic variations in SRY-negative 46,XX T/OT-DSD cases with no genetic diag-nosis. We generated an NR2F2 complete knockout (KO) in the human granulosa-like cell line COV434 and studied NR2F2-KO COV434 cell transcriptome using RNA sequencing. We also generated heterozygous and homozygous NR2F2-KO induced pluripotent stem cell (iPSC) lines from human fibroblasts using a one-step protocol for CRISPR/Cas9 gene-editing and episomal-based reprogramming. iPSCs were submitted to a stepwise protocol for differentiation into primitive streak-mesendoderm, intermediate mesoderm, and granulosa-like cells. We identified that COUP‑TFII is expressed in early supporting gonadal cells (ESGC) and regulates transcript profiles associated with early bipotent gonadal state and the first wave of pre‑granulosa cells. During the differentiation of iPSCs into granulosa-like cells, both hetero and homozygous NR2F2-KO cell lines upregulated EMX2 gene, whereas LHX9 was downregulated at protein and mRNA levels in the ho-mozygous cell line. EMX2 and LHX9 are players in the early development of the bipoten-tial gonad. The heterozygous NR2F2-KO cells expressed higher levels of both FOXL2 and AMH, markers of granulosa and fetal Sertoli cells, respectively, than their wild-type counterparts. Our findings suggest that COUP-TFII regulates the transcriptional plasticity of ESGCs and cell fate during gonad development, and NR2F2/COUP-TFII haploinsufficiency may lead to 46,XX OT-DSD through the dysregulation of bipotential gonad factors instead of downregulation of pro-ovarian genes. Finally, we performed singleton whole-genome sequencing (sWGS) and comparative genomic hybridization array (CGH-array) on two unrelated cases with no family history and one case with a family history of SRY-negative 46,XX T/OT-DSD. We detected a heterozygous 3.3 kb deletion encompassing the 3’UTR of CRIPTO gene in members of this family. However, this genetic variation was not found in one affected sibling. The affected family members present differences in their phenotypes since one individual has testicular DSD, and two others present ovotestis. Therefore, we raised the hypothesis that this inherited microdeletion in the CRIPTO locus may contribute to the variable expressivity of the phenotype in this family. Further investigations are necessary to test this hypothesis. The use of in vitro human models and a combination of next-generation sequencing and cytogenetic studies are necessary to increase our knowledge about the genetic mechanisms underlying sex development and its variations and to iden-tify new DSD candidate genes. Applying new methods, such as long-read sequencing, is a promising strategy for studying DSD cases with no molecular etiology.
- ItemEstudos da atividade biológica de peptídeos do veneno de artrópodes(Universidade Federal de São Paulo, 2024-04-05) Oliveira, Cyntia Silva de [UNIFESP]; Oliveira Junior, Vani Xavier de [UNIFESP]; Cerchiaro, Giselle; http://lattes.cnpq.br/0764162939581973; http://lattes.cnpq.br/8202238208943023; https://lattes.cnpq.br/0267332416851444Peptídeos de Defesa do Hospedeiro (PDHs) é uma denominação mais abrangente para o termo peptídeos antimicrobianos, uma vez que essas complexas moléculas, componentes do sistema imune inato, apresentam uma grande variedade de atividades biológicas; além da clássica atividade antimicrobiana, eles podem atuar como antitumorais, antibiofilmes, imunomoduladores e anti-inflamatórios, entre outros. Este estudo investigou as propriedades biológicas de versões sintéticas de PDHs, provenientes do veneno da vespa Polistes dominulus e do escorpião Opisthacanthus madagascariensis, bem como seus análogos sintéticos, incluindo análises estruturais, atividade antimicrobiana, citotóxica e antitumoral. Os PDHs de vespa, Dominulin A (DomA) e Dominulin B (DomB), são peptídeos catiônicos α-helicoidais, que apresentam elevada atividade antimicrobiana contra uma variedade de bactérias em concentrações micromolares. Ambos, apresentaram, também, promissora atividade contra células de câncer de mama, com atividade mais proeminente contra o fenótipo mais agressivo. O design de análogos truncados, denominados 14-DomA e 14-DomB, mostrou-se uma ferramenta útil para a obtenção de seletividade biológica, gerando moléculas com atividade antimicrobiana, sem proporcionar citotoxicidade contra células humanas. Por sua vez, o peptídeo de escorpião IsCT1 e seus análogos, com diferentes cargas líquidas, revelaram uma complexa relação entre estrutura e atividade antitumoral e citotóxica, mostrando que o aumento da carga líquida não possui correlação direta com a atividade antitumoral; por outro lado, foi observada a importância da estruturação helicoidal na manutenção da atividade biológica desse grupo de peptídeos. Dentre os análogos do IsCT1, o AKFK-IsCT1, desenhado com aumento moderado da carga líquida e estruturação helicoidal semelhante ao seu peptídeo nativo, apresentou proeminente redução da atividade citotóxica e hemolítica, mantendo relevante atividade antitumoral. Esse análogo mostrou grande atividade sinérgica com a terapia fotodinâmica, além de apresentar potencial imunomodulatório, em modelo animal, para câncer de mama. Esses achados fornecem insights valiosos sobre a estrutura e atividade biológica dos PDHs e de seus análogos sintéticos, destacando seu potencial como agentes promissores em diversas aplicações terapêuticas. A compreensão das propriedades e modos de ação dos PDHs pode contribuir significativamente para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, especialmente na luta contra doenças infecciosas e câncer, alinhando-se com os objetivos de saúde global preconizados pela Organização Mundial da Saúde.