PPG - Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
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- ItemAcesso aberto (Open Access)Estratégias de targeting para terapia gênica baseadas em um gene antitumoral(Universidade Federal de São Paulo, 2025-01-17) Cinel, Victor Dal Posolo; Tavassi, Ana Marisa Chudzinski; http://lattes.cnpq.br/6899353560628046; http://lattes.cnpq.br/6845346545995430Objetivo: Este trabalho teve como objetivo investigar o gene do Amblyomin-X com diferentes targetings intracelulares como um candidato a terapia gênica antitumoral. Neste estudo foi avaliado o impacto da expressão e direcionamento do Amblyomin X, uma molécula antitumoral derivada de uma biblioteca de cDNA da glândula salivar do carrapato Amblyomma sculptum, para diferentes compartimentos subcelulares e os possíveis efeitos citotóxicos, com foco em melanoma humano. Métodos: Foram desenvolvidos plasmídeos para expressar o Amblyomin-X em células humanas e direcioná-lo para diferentes destinos: secreção; translocação e retenção no retículo endoplasmático; translocação para as mitocôndrias; e uma construção para a produção do Amblyomin X sem endereçamento específico. A expressão do Amblyomin-X foi avaliada em células de melanoma SK-MEL-28 e em células não tumorais HEK-293T. Para avaliar a produção da proteína, foram utilizadas as técnicas de RT-qPCR, Western Blot e espectrometria de massas. Para avaliação do potencial citotóxico, foram realizados os ensaios de MTT, detecção de atividade de caspases 3/7 e avaliação de morte celular por citometria de fluxo. Mutações sítio-dirigidas em lisinas foram realizadas para tentar estabilizar o Amblyomin X intracelular, e o inibidor do proteassoma comercial MG132 foi utilizado para investigar o mecanismo de degradação do Amblyomin X. Além disso, foram realizadas tentativas de adaptar células HEK-293 para cultivo em meios com baixa concentração de FBS para viabilizar a purificação e avaliação do Amblyomin X secretado. Resultados: Embora todas as formas do Amblyomin X tenham sido detectadas em células HEK-293T, apenas as formas endereçadas para o retículo endoplasmático e secretadas foram identificadas em células SK-MEL-28. Não foi observado efeito citotóxico do Amblyomin X em nenhuma das duas linhagens celulares. Além disso, nas células tumorais de melanoma, foi identificada a degradação do Amblyomin X sem endereçamento e do Amblyomin X mitocondrial via ação do proteassoma. As mutações sitio-dirigidas não foram capazes de estabilizar o Amblyomin X intracelular, e os ensaios de inibição do proteassoma indicam que essas formas do Amblyomin X são degradadas de maneira independente de ubiquitinação e SUMOilação. A adaptação das células HEK-293T para meio sem FBS foi ineficaz, e a redução de FBS levou à parada da expressão do Amblyomin X secretado. Conclusões: O estudo indicou que a expressão do Amblyomin X diretamente nas células humanas enfrenta desafios, como a degradação proteassomal em células tumorais e a ausência de atividade antitumoral. Estudos para desvendar em detalhes a interação do Amblyomin X com o proteassoma são necessários para o desenvolvimento eficiente de uma terapia gênica antitumoral com o gene do Amblyomin X.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Caracterização funcional de variantes genéticas ligadas ao Angioedema Hereditário(Universidade Federal de São Paulo, 2024-12-17) Marins, Maryana Mara [UNIFESP]; Pesquero, João Bosco [UNIFESP]; Neves, Raquel Leão [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4426753884052758; http://lattes.cnpq.br/0856630824759511; http://lattes.cnpq.br/1626371860783907Angioedema Hereditário (AEH) é uma doença genética rara não monogênica sendo os tipos I e II os mais prevalentes. Os tipos I e II tem como causa variantes genéticas patogênicas no gene SERPING1, o que resulta na deficiência quantitativa e ou funcional do inibidor C1 (C1-INH). A característica clínica clássica de ambos os tipos são crises de edema em diversos locais do corpo, com gravidade, duração e frequência variáveis, podendo ser letal. Objetivo: a caracterização de uma grande deleção, bem como o estudo funcional das variantes do tipo SNV p.G184R, p.A297T, p.A457P e p.A459D no gene SERPING1. Métodos: A caracterização da grande deleção foi realizada utilizando as técnicas de sequenciamento de Sanger, MLPA, TQE, dosagem de atividade sérica da C1 esterase, western blotting e estudo de segregação familiar. Para o estudo funcional das SNVs, plasmídeos contendo as variantes pontuais foram gerados por mutação sítio dirigida, clonados e transfectados na linhagem celular HepG2. Resultados: A caracterização da grande deleção mostrou que a mesma compreende aproximadamente 6.000pb, resultando na deleção completa dos éxons 5 e 6, que altera o quadro de leitura do SERPING1 e gera um códon de parada prematuro após 24 aminoácidos, denominada p.Asp229Glyfs*24. Essa variante é considerada patogênica e relacionada ao AEH do tipo I. Os mutantes das SNVs foram validados por sequenciamento de Sanger e após cultivo das células HepG2, a expressão dos C1-INHs mutantes foi avaliada por qPCR, western blotting e espectrofotometria (dosagem enzimática indireta do C1-INH). O estudo funcional das SNVs mostrou que as variantes p.G184R, p.A457P e p.A459D podem ser consideradas patogênicas. Com os testes realizados até o momento, ainda não se pode afirmar que a variante p.A297T, isoladamente, seja patogênica. Conclusão: Esse estudo destacou a importância da análise de variantes no gene SERPING1. Nossos achados identificaram variantes causadoras da doença, o que reforça que a incorporação de testes genéticos pode contribuir para avanços no aconselhamento genético, diagnóstico e tratamento do Angioedema Hereditário.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Hidrogéis baseados em nucleotídeos de RNA para encapsulamento de quimioterápicos(Universidade Federal de São Paulo, 2024-11-04) Mori, Renata Lara [UNIFESP]; Da Silva, Emerson Rodrigo [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7800589206457326; http://lattes.cnpq.br/7602648549145007Introdução: O câncer é um dos maiores desafios de saúde da nossa época, sendo que o padrão-ouro para seu tratamento ainda é o uso de quimioterápicos, geralmente administrados por vias intravenosa ou oral. Uma classe importante de quimioterápicos são os antimetabólitos, moléculas análogas às bases nitrogenadas dos ácidos nucleicos, capazes de “enganar” as células cancerosas, levando-as a incorporar o fármaco em seu genoma e inibir sua replicação. No entanto, esses fármacos possuem efeitos colaterais que comprometem significativamente a qualidade de vida do paciente. Uma estratégia com potencial para mitigar tais efeitos é o uso de sistemas de liberação controlada, entre os quais matrizes de hidrogel ocupam posição privilegiada. Dentro desse contexto, investigamos nesta dissertação um grupo de hidrogéis híbridos formados a partir da auto-organização conjunta do amino ácido fenilalanina protegido com o grupo fluorenilmetóxido (Fmoc-Phe) e de monofostatos dos nucleosídeos de RNA guanosina (GMP), citidina (CMP) e uridina (UMP). A essas matrizes incorporamos com sucesso os antimetabólitos 5-fluoracil (5-FU) e 6-mercaptopurina (6-MP), análogos de bases purinas e pirimidinas, respectivamente. Objetivo: O objetivo principal foi desenvolver um protocolo de síntese para a obtenção de matrizes mistas de hidrogéis, combinando grupos Fmoc-Phe e nucleotídeos de RNA, capazes de encapsular os quimioterápicos 5-FU e 6-MCP. Além disso, buscamos fornecer uma caracterização estrutural completa da organização desses materiais, abrangendo desde a escala nanoscópica até propriedades mecânicas, e testar seu potencial como sistema de liberação. Métodos: O protocolo de síntese envolveu a co-solubilização dos componentes (aminoácidos, nucleotídeos e fármacos) em buffer aquoso, seguida de uma rampa térmica. As técnicas utilizadas para a caracterização das amostras incluíram microscopia de força atômica, microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia de energia dispersiva (EDS), microscopia óptica de luz polarizada, UV-Vis, espalhamento de raios X a baixo ângulo, espectroscopia de fluorescência, reologia e testes de liberação. Algumas características de citotoxicidade foram investigadas preliminarmente por meio de ensaios microbiológicos com leveduras. Resultados: Fomos bem-sucedidos na produção de hidrogéis combinando Fmoc-Phe e nucleotídeos em concentrações finais da ordem de 1%, sendo possível obter matrizes baseadas em guanosina, citidina e uridina, mas não em adenosina. A caracterização estrutural demonstrou de forma clara que essas matrizes são estabilizadas por uma rede de fibras nanoscópicas entrelaçadas, típicas de géis físicos. Ensaios de reologia mostraram que, independentemente do nucleotídeo utilizado, os módulos de armazenamento (G’) são superiores aos módulos de perda (G’’), indicando estruturas bem organizadas. O levantamento de diagramas de fase mostrou que as matrizes mantêm estabilidade até temperaturas da ordem de 40 °C, compatíveis com temperaturas fisiológicas. Foi possível incorporar nesses sistemas 6-MP em proporções da ordem de 0,3%, mantendo a estabilidade dos géis. No entanto, embora a incorporação de 5-FU tenha sido possível, observou-se a desestabilização das matrizes. Análises de microscopia eletrônica combinadas com espectroscopia de energia dispersiva mostraram que os fármacos se acumulam em domínios no interior da matriz, com cristalinidade indicada por ensaios de microscopia de luz polarizada. Ensaios de liberação de 6-MP mostraram cinéticas de primeira ordem, sendo que matrizes baseadas em GMP apresentaram taxas mais rápidas. Embora ensaios de tolerância celular em cultura de levedura tenham apontado baixa citotoxicidade, testes preliminares mostraram certa toxicidade em relação a células de mamíferos. Conclusão: Conseguimos desenvolver um protocolo simples para produzir matrizes coloidais à base de nucleotídeos e peptídeo do grupo Fmoc, incorporando os quimioterápicos 5-FU e 6-MP. No entanto, a produção de matrizes estáveis não foi possível com monofosfato de adenosina, sugerindo que o grupo carbonila disponível em todas as demais nucleobases desempenha um papel preponderante no processo de auto-organização. Através das técnicas de caracterização, foi possível observar que os quimioterápicos formam domínios cristalinos no interior das redes de nanofibras que constituem as matrizes coloidais. Todas as matrizes mantiveram estabilidade com a incorporação de 6-MP, mas foram desestabilizadas pelo 5-FU. Além disso, observou-se que esses sistemas funcionam como matrizes de liberação controlada, embora os efeitos de citotoxicidade precisem ser considerados e contornados para uso efetivo em aplicações biomédicas.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Avaliações genéticas de indivíduos portadores de neutropenia primária crônica(Universidade Federal de São Paulo, 2024-11-22) Menezes, Alef Nascimento [UNIFESP]; Pesquero, João Bosco [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0856630824759511; http://lattes.cnpq.br/9655284452340182Objetivo: Realizar avaliação bioquímica e molecular em indivíduos portadores de neutropenia crônica. Método: Estudo de coorte prospectivo, desenvolvido de 2021 a 2023, incluindo pacientes atendidos em um serviço de referência de neutropenia. Foram analisados pacientes com neutropenia congênita grave (NCG), neutropenia ciclíca (NC), neutropenia auto-imune (NA), neutropenia idiopática crônica (NI) e doença do depósito de glicogênio 1B (DAG1B). O projeto foi dividido em três etapas: genômica, análise de proteínas e transcrição. Para os ensaios de genômica, foi realizado o sequenciamento de todos os exons em busca de variantes em genes associados a neutropenia congênita. Para os ensaios de proteômica utilizou-se a técnica de Western-Blot para visualização da expressão da proteína hCAP18 e a medida da atividade das enzimas mieloperoxidase e elastase. O ensaio de expressão de RNAm do gene CAMP foi realizado pela técnica de PCR em tempo real (qPCR), utilizando RNA extraído a partir do sangue total. Resultados: Foram identificados cinco pacientes com NCG (sendo dois indivíduos parentes), dois pacientes com NC, quatro com NAI (sendo dois indivíduos parentes), dois com DDG1B e quatro com NIC. No presente estudo, observou-se que o gene associado ao maior número de variantes foi o gene ELANE. Além do mais, foram observadas três novas variantes não descritas anteriormente na literatura, sendo duas variantes presentes no gene ELANE e uma variante no gene TAFAZZIN, associadas a NCG e a NC. Após a identificação das variantes genéticas, foi avaliada a expressão do gene CAMP e observou-se uma redução da expressão desse gene em indivíduos portadores de NCG quando comparado com outras neutropenias. Como o gene CAMP codifica a proteína hCAP18, foi realizada a avaliação da expressão dessa proteína nos pacientes portadores de neutropenia crônica. Os resultados mostraram ausência de expressão da hCAP18 nos pacientes com NCG, apresentando níveis indetectáveis também após o uso da medicação de proliferação celular na medula (filgrastrim). Nos indivíduos com NC, observou-se a ausência da expressão da hCAP18 durante a fase neutropênica, porém com expressão evidente na fase de recuperação neutrofílica. A expressão do hCAP18 também foi detectada nos pacientes com NAI, NIC e DDG1B, apesar da neutropenia pronunciada, e no grupo controle. Dessa forma, para avaliar o nível de maturação dos neutrófilos dos indivíduos portadores de NCG e NC, avaliou-se a atividade da mieloperoxidase e da elastase, havendo uma diminuição considerável nos indivíduos com variantes no gene ELANE, o que pode estar acarretando em um pior prognóstico dessas enfermidades. Conclusão: Dessa forma, a investigação molecular e bioquímica, juntamente com a associação de outras técnicas, como a pesquisa da expressão dos níveis plasmáticos do hCAP18 podem ser ferramentas poderosas de triagem destas doenças, diminuindo a necessidade de testes invasivos, inclusive ainda na infância, podendo viabilizar um tratamento precoce, similar a deficiência de glicose-6-fosfato.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Óxido nítrico como um mediador da adaptação celular em resposta ao estresse nutricional em células de melanoma metastático humano SK-MEL-28(Universidade Federal de São Paulo, 2024-11-08) Barboza, Leticia Torres [UNIFESP]; Monteiro, Hugo Pequeno [UNIFESP]; Simabuco, Fernando Moreira; http://lattes.cnpq.br/6362783289622710; http://lattes.cnpq.br/6154759166234850; https://lattes.cnpq.br/3888835062633252O melanoma é o tipo mais agressivo de câncer de pele, com alta taxa de mortalidade devido à sua rápida progressão e capacidade metastática. Durante sua progressão, a proliferação acelerada das células tumorais leva à limitação no suprimento de oxigênio, fatores de crescimento e outros nutrientes, promovendo condições de estresse que desencadeiam adaptações celulares essenciais para a sobrevivência, proliferação e promoção de metástases. As vias de sinalização PI3K/Akt/mTOR (PI3K) e Ras/Raf/MEK/ERK (MAPK) são vias canonicamente alteradas no melanoma, que desempenham papéis cruciais na resposta ao estresse e na progressão tumoral, regulando processos de sobrevivência, crescimento e diferenciação celular. Além disso, o óxido nítrico (NO), atua como um modulador chave no câncer, incluindo o melanoma, ao regular vias oncogênicas como PI3K e MAPK, através da sinalização por S-nitrosilação. Este estudo teve como objetivo investigar o papel do NO na adaptação celular de células de melanoma metastático humano (SK-MEL-28) sob estresse nutricional induzido pela privação de soro fetal bovino (SFB). Foram realizadas análises de proliferação, morfologia celular, expressão e ativação de proteínas das vias PI3K e MAPK, quantificação dos níveis de NO, além de ensaios de clonogenicidade. Nossos resultados indicam que a privação de SFB reduz a proliferação celular, altera a morfologia e modula a expressão e ativação das vias PI3K e MAPK, além de promover um aumento significativo nos níveis de NO. Nessas condições, tratamento com o doador de NO (DETA-NONOato) aumentou NO a níveis suprafisiológicos, suprimindo a proliferação e a ativação das vias mencionadas. . Por outro lado, a inibição da produção de NO por L-NAME restaurou parcialmente o fenótipo de células incubadas na presença de SFB, modulando também a expressão do fator de transcrição MITF e a capacidade de formação de colônias. Esses achados sugerem que o NO desempenha um papel modulador na adaptação celular em resposta ao estresse nutricional, o que pode oferecer novas perspectivas terapêuticas para o tratamento do melanoma metastático, considerando a limitação das terapias atuais em lidar com a resistência tumoral característica do melanoma.