Estratégias de targeting para terapia gênica baseadas em um gene antitumoral

Data
2025-01-17
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Objetivo: Este trabalho teve como objetivo investigar o gene do Amblyomin-X com diferentes targetings intracelulares como um candidato a terapia gênica antitumoral. Neste estudo foi avaliado o impacto da expressão e direcionamento do Amblyomin X, uma molécula antitumoral derivada de uma biblioteca de cDNA da glândula salivar do carrapato Amblyomma sculptum, para diferentes compartimentos subcelulares e os possíveis efeitos citotóxicos, com foco em melanoma humano. Métodos: Foram desenvolvidos plasmídeos para expressar o Amblyomin-X em células humanas e direcioná-lo para diferentes destinos: secreção; translocação e retenção no retículo endoplasmático; translocação para as mitocôndrias; e uma construção para a produção do Amblyomin X sem endereçamento específico. A expressão do Amblyomin-X foi avaliada em células de melanoma SK-MEL-28 e em células não tumorais HEK-293T. Para avaliar a produção da proteína, foram utilizadas as técnicas de RT-qPCR, Western Blot e espectrometria de massas. Para avaliação do potencial citotóxico, foram realizados os ensaios de MTT, detecção de atividade de caspases 3/7 e avaliação de morte celular por citometria de fluxo. Mutações sítio-dirigidas em lisinas foram realizadas para tentar estabilizar o Amblyomin X intracelular, e o inibidor do proteassoma comercial MG132 foi utilizado para investigar o mecanismo de degradação do Amblyomin X. Além disso, foram realizadas tentativas de adaptar células HEK-293 para cultivo em meios com baixa concentração de FBS para viabilizar a purificação e avaliação do Amblyomin X secretado. Resultados: Embora todas as formas do Amblyomin X tenham sido detectadas em células HEK-293T, apenas as formas endereçadas para o retículo endoplasmático e secretadas foram identificadas em células SK-MEL-28. Não foi observado efeito citotóxico do Amblyomin X em nenhuma das duas linhagens celulares. Além disso, nas células tumorais de melanoma, foi identificada a degradação do Amblyomin X sem endereçamento e do Amblyomin X mitocondrial via ação do proteassoma. As mutações sitio-dirigidas não foram capazes de estabilizar o Amblyomin X intracelular, e os ensaios de inibição do proteassoma indicam que essas formas do Amblyomin X são degradadas de maneira independente de ubiquitinação e SUMOilação. A adaptação das células HEK-293T para meio sem FBS foi ineficaz, e a redução de FBS levou à parada da expressão do Amblyomin X secretado. Conclusões: O estudo indicou que a expressão do Amblyomin X diretamente nas células humanas enfrenta desafios, como a degradação proteassomal em células tumorais e a ausência de atividade antitumoral. Estudos para desvendar em detalhes a interação do Amblyomin X com o proteassoma são necessários para o desenvolvimento eficiente de uma terapia gênica antitumoral com o gene do Amblyomin X.
Objective: This work aimed to investigate the Amblyomin-X gene with different intracellular targetings as a candidate for antitumor gene therapy. The study evaluated the impact of the expression and targeting of Amblyomin X, an antitumor molecule derived from a cDNA library of the salivary gland of the tick Amblyomma sculptum, to different subcellular compartments and its potential cytotoxic effects, with a focus on human melanoma. Methods: Plasmids were developed to express Amblyomin X in human cells and target it to different destinations: secretion; translocation and retention in the endoplasmic reticulum; translocation to mitochondria; and a construct for the production of Amblyomin X without specific targeting. Amblyomin X expression was evaluated in SK-MEL-28 melanoma cells and in non-tumor HEK-293T cells. To evaluate protein production, RT-qPCR, Western Blot and mass spectrometry techniques were used. To evaluate the cytotoxic potential, MTT assays, detection of caspase 3/7 activity and evaluation of cell death by flow cytometry were performed. Site-directed mutations in lysines were performed to try to stabilize intracellular Amblyomin X, and the commercial proteasome inhibitor MG132 was used to investigate the mechanism of Amblyomin X degradation. In addition, attempts were made to adapt HEK-293 cells to culture in media with low FBS concentration to enable purification and evaluation of secreted Amblyomin X. Results: Although all forms of Amblyomin X were detected in HEK-293T cells, only the endoplasmic reticulum-bound and secreted forms were identified in SK-MEL-28 cells. No cytotoxic effect of Amblyomin X was observed in either cell line. Furthermore, in melanoma tumor cells, proteasome degradation of Amblyomin X without specific targeting and mitochondrial Amblyomin X was identified. Site-directed mutations were unable to stabilize intracellular Amblyomin X, and proteasome inhibition assays showed that these forms of Amblyomin X are degraded in a manner independent of ubiquitination and SUMOylation. Adaptation of HEK-293T cells to medium without FBS was ineffective, and reduction of FBS led to the cessation of expression of secreted Amblyomin X. Conclusions: The study indicated that direct expression of Amblyomin X in human cells faces challenges, such as proteasomal degradation in tumor cells and the absence of antitumor activity. Studies to unravel in detail the interaction of Amblyomin X with the proteasome are necessary for the efficient development of an antitumor gene therapy with the AMB gene.
Descrição
Citação
CINEL, Victor Dal Posolo. Estratégias de targeting para terapia gênica baseadas em um gene antitumoral. 2024. 108 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas: Biologia Molecular) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2024.
ODS

3. Saúde e bem-estar

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