Caracterização ultraestrutural da parede de microrganismos sob ação do CPP AIP6
Data
2023-09-12
Autores
Souza, Louise Eloá Araújo 
Orientadores
Silva, Emerson Rodrigo da
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Introdução: O penta peptídeo RLRWR (AIP6) pertence ao grupo dos peptídeos de penetração celular (CPPs) mais curtos já reportados na literatura. A presença de argininas em sua composição confere grande cationicidade a esta sequência, tornando-a também candidata a apresentar propriedades antimicrobianas. Embora a interação de CPPs com células de mamífero seja amplamente investigada, estudos sobre os efeitos dessas moléculas sobre a parede celular de microrganismos não são realizados com a mesma intensidade. Nesta dissertação, investigamos a interação do peptídeo AIP6 com a parede celular de microrganismos-modelo utilizando técnicas de microscopia de força atômica (AFM) capazes de fornecer detalhes físico-químicos com resolução ultra alta. Desenvolvemos protocolos de análise que nos permitiram obter detalhes tridimensionais dessas interfaces, tanto em amostras fixadas quanto em células vivas mantidas em meio líquido. Também realizamos a caracterização da assinatura espectroscópica da parede em escala nanoscópica. Até onde temos conhecimento, trata-se da primeira vez que a ação de CPPs é avaliada por meio da combinação dessas técnicas de microscopia. Objetivo: obtenção de detalhes tridimensionais, em escala nanométrica, de paredes de procariotos e eucariotos submetidos à ação de um CPP. Além disso, também investigamos a assinatura espectroscópica dessas superfícies por meio da combinação de AFM com espectroscopia de infravermelho. Por fim, também pretendemos fornecer informações sobre o comportamento físico-químico do peptídeo e de sua capacidade de nanoestruturação. Materiais e métodos: O comportamento de nanoestruturação do peptídeo foi avaliado por fluorimetria, enquanto sua estrutura secundária foi avaliada por dicroísmo circular. Os modelos celulares procariotos foram as bactérias E. coli e B. subtilis, enquanto o modelo eucarioto foi a levedura S. cerevisiae. As células foram cultivadas em meios nutrientes padrão, sendo a concentração inibitória mínima (MIC) do AIP6 determinada pelo método de diluição seriada com análise de densidade ótica ao longo do tempo. Experimentos de AFM convencional e de nanoespectroscopia (AFM-IR) foram realizados em lâminas fixadas contendo células previamente incubadas com o peptídeo. Análises em células vivas foram realizadas em BioAFM.. Resultados e discussão: Foram encontradas MICs de 0.07 e 0.6 mg/mL, respectivamente, para bactérias Gram-positivas da espécie B. subtilis e Gram-negativas do tipo E. coli. As análises ultraestruturais da parede permitiram a observação de deformações, bem como a formação de domínios peptídicos foi identificada através da assinatura espectroscópica. No caso de células de levedura, não foram observadas grandes deformações, no entanto, verificamos em espectroscopia de infravermelho a aparição de várias vibrações que sugerem que o peptídeo estimula a produção de beta-glucanos em S. cerevisae. Conclusão: O peptídeo AIP6 mostrou afinidade pelas paredes celulares de bactérias, especialmente B. subtilis, enquanto não foi verificada ação antimicrobiana contra S. cerevisae. Nos procariotos, foi observada a formação de domínios peptídicos que provavelmente induzem a formação de poros. No caso de eucariotos, também foi verificada a formação de alguns domínios peptídicos, porém, em grau muito menor. Nesse caso, encontramos dados que sugerem que o AIP6 estimula a produção de beta-glucanos que recobrem a parede celular e facilitam a agregação entre células de levedura.