Avaliação do vetor retroviral bicistrônico Codificador de endostatina e interleucina-2 Para utilização em terapia gênica anti-tumoral
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Data
2010-07-28
Autores
Rocha, Flavia Gomes de Goes 
Orientadores
Bellini, Maria Helena
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Gene therapy has been used in preclinical studies and clinical trials in order to assuage or cure a disease. Retroviral vectors are tools for gene transfer are widely used. Bicistronic vectors are attractive alternatives for treatment of complex disease. Endostatin (ES), the C-terminal fragment of collagen XVIII, is a potent angiogenesis inhibitor. At present, ES has been widely used in a variety of experimental tumor models and clinical trial. Immunotherapy, with interleukin-2 (IL-2), has been used as adjuvant treatment for tumors in several preclinical studies and clinical trials. The objective of this project was evaluated an IRES-based bicistronic retroviral vector encoding ES and IL-2, in anti-tumor gene therapy. In this study, the potential of Bicistronic therapy on activation of tumorinfiltrating lymphocytes in metastatic renal cell carcinoma (mRCC) was examined, using an orthotopic metastatic mouse model. Renca cells were injected into the renal subcapsule of BALB/C mice. After seven days, the nefrectomy was performed. Then, the animals were randomly divided into two groups (10 mice/group): control and the second group of mice received a subcutaneous inoculation of NIH/3T3-LendSN-IRES-IL-2 cells. Ten days after the nefrectomy, the animals were exsanguinated and killed. In the survival studies, daily mice were monitored daily, until they died. At the end of the in vivo experiment, serum levels of IL-2 and ES were measured, the lung was weighed, and number of nodule mestastatic, nodule area, microvascular area (MVA), proliferation of RenCa cells infiltrating tumor cells, plus tumors-infiltrating lymphocytes were evaluated. There was a significant decrease in the number of metastatic lung nodules, wet weight, lung nodule area, MVA and proliferation of Renca cells in the Bicistronic-treated group compared to the control group. These significant differences revealed an antitumor effect on the bicistronic (ES+IL-2) treatment. Subcutaneous inoculation of NIH/3T3- LendSNIRES-IL-2 cells resulted in an increase in ES and IL-2 levels and in the infiltration of CD4, CD4 producer IFNg, CD8, CD8 producer IFNg and NK (CD49b) cells in the treated group. The Bicistronic therapy Kaplan Meier survival curves showed that the probability of survival was significantly higher for mice treated (log-rank test, P=0.0016). Concluding, retroviral ES and IL-2 gene transfer led to secretion of functional ES and IL-2 that were sufficiently active to inhibit tumor angiogenesis and tumor growth, increasing the infiltration of immune cells.
A terapia gênica tem sido empregada em estudos pré-clínicos e clínicos, com o intuito de amenizar ou curar uma doença. Vetores retrovirais são ferramentas de transferências gênica largamente utilizadas. Vetores retrovirais bicistrônico é uma alternativa interessante para o tratamento de doenças complexas. A endostatina (ES), fragmento do colágeno XVIII, tem sido utilizada na terapia anti-angiogênica, devido sua ação inibitória no crescimento de células endoteliais. A imunoterapia tem sido utilizada como tratamento coadjuvante de tumores. Dentre as citocinas utilizadas, a interleucina-2 (IL-2) promovendo a proliferação de linfócitos T, tem sido utilizada em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. O objetivo deste projeto foi avaliar um vetor retroviral bicistrônico codificando ES e IL-2, utilizando a sequência IRES, na terapia gênica anti-tumoral. Neste estudo, foi avaliado o potencial do vetor bicistrônico na ativação da infiltração linfocitária em carcinoma renal metastático, utilizando um modelo ortotópico metastático. Células Renca foram injetadas na subcápsula renal de camundongos Balb/C. Após 7 dias, foi realizado a nefrectomia nesses animais. Os animais foram foram divididos igualmente em dois grupos. Um grupo foi o controle e o segundo grupo recebeu a inoculação subcutânea de células NIH/3T3-LendSN-IRES-IL-2. Dez dias após à nefrectomia, os animais foram exsanguinados e sacrificados para a retirada dos pulmões. No estudo de sobrevivência, os animais foram monitorados até a morte. No final dos experimentos in vivo, os níveis séricos de ES e de IL-2 circulantes foram avaliados, o pulmão foi pesado e os números dos nódulos metastático foram quantificados, assim como, a área nodular e a área microvascular intranodais. A proliferação das Células Renca, a infiltração e ativação linfocitária dentro dos nódulos metastáticos foram avaliados. Houve uma diminuição significativa no número de nódulos metastáticos, no peso pulmonar, na área nodular e microvascular e na proliferação das células Renca dentro dos nódulos metastáticos, no grupo tratado com o vetor bicistrônico quando comparado com o grupo controle. Essas significantes deiferenças revelam o efeito anti-tumoral no tratamento com ES+IL-2. A inoculação subcutânea das células NIH/3T3-LendSN-IRES-IL-2 promoveu um significativo aumento nos níveis séricos de ES e IL-2 circulantes, como também, na infiltração de células CD4, CD4 secretoras de IFN-g, CD8, CD8 secretoras de IFN-g e de células Natural Killer (NK). A curva de sobrevivência mostrou que a probabilidade de sobrevida foi significantemente maior nos animais tratados. Em conclusão, a transferência gênica retroviral de ES e IL-2, resultou em uma produção de ES e IL-2, as quais apresentaram suficientemente ativas para a inibição da angiogênese e do crescimento tumoral, com aumento da infiltração das células do sistema imune.
A terapia gênica tem sido empregada em estudos pré-clínicos e clínicos, com o intuito de amenizar ou curar uma doença. Vetores retrovirais são ferramentas de transferências gênica largamente utilizadas. Vetores retrovirais bicistrônico é uma alternativa interessante para o tratamento de doenças complexas. A endostatina (ES), fragmento do colágeno XVIII, tem sido utilizada na terapia anti-angiogênica, devido sua ação inibitória no crescimento de células endoteliais. A imunoterapia tem sido utilizada como tratamento coadjuvante de tumores. Dentre as citocinas utilizadas, a interleucina-2 (IL-2) promovendo a proliferação de linfócitos T, tem sido utilizada em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. O objetivo deste projeto foi avaliar um vetor retroviral bicistrônico codificando ES e IL-2, utilizando a sequência IRES, na terapia gênica anti-tumoral. Neste estudo, foi avaliado o potencial do vetor bicistrônico na ativação da infiltração linfocitária em carcinoma renal metastático, utilizando um modelo ortotópico metastático. Células Renca foram injetadas na subcápsula renal de camundongos Balb/C. Após 7 dias, foi realizado a nefrectomia nesses animais. Os animais foram foram divididos igualmente em dois grupos. Um grupo foi o controle e o segundo grupo recebeu a inoculação subcutânea de células NIH/3T3-LendSN-IRES-IL-2. Dez dias após à nefrectomia, os animais foram exsanguinados e sacrificados para a retirada dos pulmões. No estudo de sobrevivência, os animais foram monitorados até a morte. No final dos experimentos in vivo, os níveis séricos de ES e de IL-2 circulantes foram avaliados, o pulmão foi pesado e os números dos nódulos metastático foram quantificados, assim como, a área nodular e a área microvascular intranodais. A proliferação das Células Renca, a infiltração e ativação linfocitária dentro dos nódulos metastáticos foram avaliados. Houve uma diminuição significativa no número de nódulos metastáticos, no peso pulmonar, na área nodular e microvascular e na proliferação das células Renca dentro dos nódulos metastáticos, no grupo tratado com o vetor bicistrônico quando comparado com o grupo controle. Essas significantes deiferenças revelam o efeito anti-tumoral no tratamento com ES+IL-2. A inoculação subcutânea das células NIH/3T3-LendSN-IRES-IL-2 promoveu um significativo aumento nos níveis séricos de ES e IL-2 circulantes, como também, na infiltração de células CD4, CD4 secretoras de IFN-g, CD8, CD8 secretoras de IFN-g e de células Natural Killer (NK). A curva de sobrevivência mostrou que a probabilidade de sobrevida foi significantemente maior nos animais tratados. Em conclusão, a transferência gênica retroviral de ES e IL-2, resultou em uma produção de ES e IL-2, as quais apresentaram suficientemente ativas para a inibição da angiogênese e do crescimento tumoral, com aumento da infiltração das células do sistema imune.
Descrição
Citação
ROCHA, Flavia Gomes de Goes. Avaliação do vetor retroviral bicistrônico Codificador de endostatina e interleucina-2 Para utilização em terapia gênica anti-tumoral. 2010. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2010.