Terapia celular e regeneração endotelial induzida farmacologicamente: estratégias para otimizar o uso de córneas doadas
Arquivos
Data
2023-12-29
Autores
Silva, Francisco Bandeira e 
Orientadores
Gomes, José Álvaro Pereira
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Objetivos: Esta tese de doutorado teve como objetivo explorar os efeitos dos inibidores da Rho-quinase (iROCK) em células endoteliais primárias da córnea humana (CECH) e sua aplicação potencial em doenças endoteliais da córnea. Os objetivos específicos foram: (1) avaliar inibidores da Rho-quinase alternativos com melhor acessibilidade, mantendo ou superando a eficácia e segurança das moléculas já investigadas (Y27632 e ripasudil) para uso em cultura endotelial e aplicação clínica na regeneração autóloga do endotélio disfuncional; (2) investigar a capacidade de crescimento e funcionalidade CECH expandidas de córneas de doadores mais velhos que 60 anos, usando cultura organotípica; e (3) estabelecer um procedimento de cultura padronizado para CECH a serem usadas em terapia de injeção celular com um novo método de adesão e rastreamento celular. Métodos: 1. Simulação de ligação in sílico: Várias classes de inibidores ROCK foram comparadas a ROCK-I e ROCK-II para determinar sua força de ligação; Avaliação dos inibidores ROCK em CECH primárias: nove inibidores ROCK foram avaliados quanto a seus efeitos na proliferação celular e aderência in vitro usando CECs primárias; Modelo ex vivo de fechamento de feridas corneanas: O impacto do AR-13324 no fechamento de feridas corneanas foi avaliado, usando um modelo ex vivo e análises comparativas foram realizadas, usando o Y-27632 como controle; 2. Capacidade de crescimento e funcionalidade de CECH de doadores > 60 anos: CECH foram expandidas a partir de córneas de doadores idosos, usando cultura organotípica e várias análises foram realizadas, incluindo avaliação morfométrica; 3. Procedimento de cultura padronizado para CECH: dois métodos de adesão (gravitacional e magnético) foram comparados para a terapia celular em um modelo ex vivo com córneas humanas e com injeção de CECH em coelhos; imunocitoquímica e medição da resistência elétrica transendotelial (RETE). Resultados: 1. Simulação in silico: A maioria dos inibidores ROCK avaliados apresentou maior força de ligação do que Y-27632; Avaliação dos inibidores ROCK em CECH primárias: AR-13324 e seu metabólito ativo, AR-13503, apresentaram melhor aderência celular e taxas de proliferação em comparação com Y-27632; Modelo ex vivo de fechamento de feridas corneanas: AR-13324 mostrou taxas comparáveis de cicatrização de feridas ao Y-27632, sugerindo seu potencial como candidato terapêutico; 2. Capacidade de crescimento e funcionalidade de CECH de doadores > 60 anos: Culturas funcionais de CECH foram obtidas com sucesso a partir de córneas de doadores idosos usando protocolos simplificados e padronizados; 3. Procedimento de cultura padronizado para CECH: A adesão de CECH com ambos os métodos foi comparável no modelo ex vivo e in vivo, com restauração da transparência das córneas dos animais. Conclusões: Foi demonstrado o potencial de vários inibidores ROCK, particularmente o AR-13324, para as estratégias de terapia celular ou regeneração farmacologicamente induzida no tratamento de doenças endoteliais da córnea. Os resultados sugerem que o AR-13324 poderia servir como um candidato promissor para tratamento regenerativo em doenças endoteliais da córnea. Ademais, também observamos que procedimentos de cultura padronizados oferecem uma abordagem viável para obter culturas funcionais de CECH a partir de córneas de doadores idosos, apresentando uma possível fonte de células para transplantes. Além disso, ambos os métodos de injeção de CECH cultivadas foram capazes de reverter a disfunção endotelial em coelhos. Ademais, esses resultados têm implicações significativas para os campos da oftalmologia, transplante de córnea e medicina regenerativa.
Objectives: This doctoral thesis aimed to explore the effects of Rho-kinase inhibitors (iROCK) on primary human corneal endothelial cells (HCECs) and their potential application in corneal endothelial diseases. The specific objectives were (1) to investigate alternative Rho-kinase inhibitors with improved accessibility while maintaining or surpassing the efficacy and safety of the molecules already investigated (Y27632 and ripasudil) for use in endothelial culture and clinical application in autologous regeneration of dysfunctional endothelium, (2) to investigate the growth and functionality of expanded HCECs from donor corneas older than 60 years-old using an organotypic culture, and, (3) to establish a standardized culture procedure for HCECs to be used in cell injection therapy with a novel cell adhesion and tracking method. Methods: 1. In silico binding simulation: Various classes of ROCK inhibitors were compared with ROCK-I and ROCK-II to determine their binding strength; evaluation of ROCK inhibitors on primary HCECs: Nine ROCK inhibitors were assessed for their effects on cell proliferation and in vitro adhesion using primary HCECs; Ex vivo model of corneal wound closure: The impact of AR-13324 on corneal wound closure was evaluated using an ex vivo model, and comparative analyses were performed using Y-27632 as a control; 2. Growth and functionality of HCECs from donors > 60 years-old: HCECs were expanded from elderly donor corneas using organotypic culture, and various analyses were performed, including morphometric evaluation, immunocytochemistry, and measurement of transendothelial electrical resistance (TEER); 3. Standardized culture procedure for HCECs: Two adhesion methods (gravitational and magnetic) were compared for cell therapy in an ex vivo model with human corneas and injection of HCECs in rabbits. Results: 1. In silico simulation: Most evaluated ROCK inhibitors showed higher binding strength than Y- 27632; Evaluation of ROCK inhibitors on primary CECs: AR-13324 and its active metabolite, AR-13503, exhibited better cell adhesion and proliferation rates compared to Y-27632; Ex vivo model of corneal wound closure: AR-13324 demonstrated comparable wound healing rates to Y-27632, suggesting its potential as a therapeutic candidate; 2. Growth and functionality of HCECs from donors > 60 years old: Functional HCEC cultures were successfully obtained from elderly donor corneas using simplified and standardized protocols; 3. Standardized culture procedure for HCECs: Cell adhesion with both methods was comparable in the ex vivo and in vivo model, with restoration of corneal transparency in the animals. Conclusions: The potential of several ROCK inhibitors, particularly AR-13324, for cell therapy strategies or pharmacologically induced regeneration in the treatment of corneal endothelial diseases has been demonstrated. The results suggest that AR-13324 could serve as a promising candidate for regenerative treatment in corneal endothelial diseases. Furthermore, standardized culture procedures offered a viable approach to obtain functional HCEC cultures from elderly donor corneas, providing a possible source of cells for transplants. Additionally, both methods of injected cultured HCECs were able to reverse endothelial dysfunction in rabbits. These results have significant implications for the fields of ophthalmology, corneal transplantation, and regenerative medicine.
Objetivos: Esta tesis doctoral tuvo como objetivo explorar los efectos de los inhibidores de la Rho-quinasa (iROCK) en células endoteliales corneales humanas primarias (CECH) y su posible aplicación en enfermedades endoteliales corneales. Los objetivos específicos fueron (1) investigar inhibidores alternativos de la Rho- quinasa con una mejor accesibilidad, manteniendo o superando la eficacia y seguridad de las moléculas ya investigadas (Y27632 y ripasudil) para su uso en cultivos endoteliales y su aplicación clínica en la regeneración autóloga del endotelio disfuncional, (2) investigar el crecimiento y la funcionalidad de las CECH expandidas a partir de córneas de donantes de edad avanzada utilizando un cultivo organotípico, y (3) establecer un procedimiento de cultivo estandarizado para las CECH que se utilizarán en la terapia de inyección celular con un novedoso método de adhesión y seguimiento celular. Métodos: 1. Simulación de unión in silico: Se compararon varias clases de inhibidores de ROCK con ROCK-I y ROCK-II para determinar su fuerza de unión; evaluación de inhibidores de ROCK en CECH primarias: Nueve inhibidores de ROCK se evaluaron en cuanto a sus efectos en la proliferación celular y la adhesión in vitro utilizando CECH primarias; Modelo ex vivo de cierre de heridas corneales: Se evaluó el impacto de AR-13324 en el cierre de heridas corneales utilizando un modelo ex vivo, y se realizaron análisis comparativos utilizando Y-27632 como control; 2. Crecimiento y funcionalidad de las CECH de donantes de edad > 60 años: las CECH se expandieron a partir de córneas de donantes de edad avanzada utilizando un cultivo organotípico, y se realizaron diversas análisis, incluyendo evaluación morfométrica, inmunocitoquímica y medición de la resistencia eléctrica transendotelial (RETE); 3. Procedimiento de cultivo estandarizado para CECH: Se compararon dos métodos de adhesión (gravitacional y magnético) para la terapia celular en un modelo ex vivo con córneas humanas y la inyección de CECH en conejos. Resultados: 1. Simulación in silico: La mayoría de los inhibidores de ROCK evaluados mostraron una mayor fuerza de unión que Y-27632; Evaluación de inhibidores de ROCK en CECH primarias: AR-13324 y su metabolito activo, AR-13503, exhibieron una mejor adhesión celular y tasas de proliferación en comparación con Y-27632; modelo ex vivo de cierre de heridas corneales: AR-13324 demostró tasas de cicatrización de heridas comparables a las de Y-27632, lo que sugiere su potencial como candidato terapéutico; 2. Crecimiento y funcionalidad de las CECH de donantes de edad > 60 anõs: Se obtuvieron con éxito cultivos funcionales de CECH a partir de córneas de donantes de edad avanzada utilizando protocolos simplificados y estandarizados; 3. Procedimiento de cultivo estandarizado para CECH: La adhesión celular con ambos los métodos fue comparable en el modelo ex vivo e in vivo, con restauración de la transparencia corneal en los animales. Conclusiones: Se ha demostrado el potencial de varios inhibidores de ROCK, en particular el AR-13324, para estrategias de terapia celular o regeneración inducida farmacológicamente en el tratamiento de enfermedades endoteliales de la córnea. Los resultados sugieren que AR-13324 podría servir como un candidato prometedor para el tratamiento regenerativo de enfermedades endoteliales corneales. Tambíen observamos que los procedimientos de cultivo estandardizados ofrecen un enfoque viable para obtener cultivos funcionales de CECH a partir de córneas de donantes de edad avanzada, lo que proporciona una posible fuente de células para trasplantes. Además, ambos métodos de inyección de CECH cultivadas fueron capaces de revertir la disfunción endotelial en conejos. Estos resultados tienen importantes implicaciones en los campos de la oftalmología, el trasplante corneal y la medicina regenerativa.
Objectives: This doctoral thesis aimed to explore the effects of Rho-kinase inhibitors (iROCK) on primary human corneal endothelial cells (HCECs) and their potential application in corneal endothelial diseases. The specific objectives were (1) to investigate alternative Rho-kinase inhibitors with improved accessibility while maintaining or surpassing the efficacy and safety of the molecules already investigated (Y27632 and ripasudil) for use in endothelial culture and clinical application in autologous regeneration of dysfunctional endothelium, (2) to investigate the growth and functionality of expanded HCECs from donor corneas older than 60 years-old using an organotypic culture, and, (3) to establish a standardized culture procedure for HCECs to be used in cell injection therapy with a novel cell adhesion and tracking method. Methods: 1. In silico binding simulation: Various classes of ROCK inhibitors were compared with ROCK-I and ROCK-II to determine their binding strength; evaluation of ROCK inhibitors on primary HCECs: Nine ROCK inhibitors were assessed for their effects on cell proliferation and in vitro adhesion using primary HCECs; Ex vivo model of corneal wound closure: The impact of AR-13324 on corneal wound closure was evaluated using an ex vivo model, and comparative analyses were performed using Y-27632 as a control; 2. Growth and functionality of HCECs from donors > 60 years-old: HCECs were expanded from elderly donor corneas using organotypic culture, and various analyses were performed, including morphometric evaluation, immunocytochemistry, and measurement of transendothelial electrical resistance (TEER); 3. Standardized culture procedure for HCECs: Two adhesion methods (gravitational and magnetic) were compared for cell therapy in an ex vivo model with human corneas and injection of HCECs in rabbits. Results: 1. In silico simulation: Most evaluated ROCK inhibitors showed higher binding strength than Y- 27632; Evaluation of ROCK inhibitors on primary CECs: AR-13324 and its active metabolite, AR-13503, exhibited better cell adhesion and proliferation rates compared to Y-27632; Ex vivo model of corneal wound closure: AR-13324 demonstrated comparable wound healing rates to Y-27632, suggesting its potential as a therapeutic candidate; 2. Growth and functionality of HCECs from donors > 60 years old: Functional HCEC cultures were successfully obtained from elderly donor corneas using simplified and standardized protocols; 3. Standardized culture procedure for HCECs: Cell adhesion with both methods was comparable in the ex vivo and in vivo model, with restoration of corneal transparency in the animals. Conclusions: The potential of several ROCK inhibitors, particularly AR-13324, for cell therapy strategies or pharmacologically induced regeneration in the treatment of corneal endothelial diseases has been demonstrated. The results suggest that AR-13324 could serve as a promising candidate for regenerative treatment in corneal endothelial diseases. Furthermore, standardized culture procedures offered a viable approach to obtain functional HCEC cultures from elderly donor corneas, providing a possible source of cells for transplants. Additionally, both methods of injected cultured HCECs were able to reverse endothelial dysfunction in rabbits. These results have significant implications for the fields of ophthalmology, corneal transplantation, and regenerative medicine.
Objetivos: Esta tesis doctoral tuvo como objetivo explorar los efectos de los inhibidores de la Rho-quinasa (iROCK) en células endoteliales corneales humanas primarias (CECH) y su posible aplicación en enfermedades endoteliales corneales. Los objetivos específicos fueron (1) investigar inhibidores alternativos de la Rho- quinasa con una mejor accesibilidad, manteniendo o superando la eficacia y seguridad de las moléculas ya investigadas (Y27632 y ripasudil) para su uso en cultivos endoteliales y su aplicación clínica en la regeneración autóloga del endotelio disfuncional, (2) investigar el crecimiento y la funcionalidad de las CECH expandidas a partir de córneas de donantes de edad avanzada utilizando un cultivo organotípico, y (3) establecer un procedimiento de cultivo estandarizado para las CECH que se utilizarán en la terapia de inyección celular con un novedoso método de adhesión y seguimiento celular. Métodos: 1. Simulación de unión in silico: Se compararon varias clases de inhibidores de ROCK con ROCK-I y ROCK-II para determinar su fuerza de unión; evaluación de inhibidores de ROCK en CECH primarias: Nueve inhibidores de ROCK se evaluaron en cuanto a sus efectos en la proliferación celular y la adhesión in vitro utilizando CECH primarias; Modelo ex vivo de cierre de heridas corneales: Se evaluó el impacto de AR-13324 en el cierre de heridas corneales utilizando un modelo ex vivo, y se realizaron análisis comparativos utilizando Y-27632 como control; 2. Crecimiento y funcionalidad de las CECH de donantes de edad > 60 años: las CECH se expandieron a partir de córneas de donantes de edad avanzada utilizando un cultivo organotípico, y se realizaron diversas análisis, incluyendo evaluación morfométrica, inmunocitoquímica y medición de la resistencia eléctrica transendotelial (RETE); 3. Procedimiento de cultivo estandarizado para CECH: Se compararon dos métodos de adhesión (gravitacional y magnético) para la terapia celular en un modelo ex vivo con córneas humanas y la inyección de CECH en conejos. Resultados: 1. Simulación in silico: La mayoría de los inhibidores de ROCK evaluados mostraron una mayor fuerza de unión que Y-27632; Evaluación de inhibidores de ROCK en CECH primarias: AR-13324 y su metabolito activo, AR-13503, exhibieron una mejor adhesión celular y tasas de proliferación en comparación con Y-27632; modelo ex vivo de cierre de heridas corneales: AR-13324 demostró tasas de cicatrización de heridas comparables a las de Y-27632, lo que sugiere su potencial como candidato terapéutico; 2. Crecimiento y funcionalidad de las CECH de donantes de edad > 60 anõs: Se obtuvieron con éxito cultivos funcionales de CECH a partir de córneas de donantes de edad avanzada utilizando protocolos simplificados y estandarizados; 3. Procedimiento de cultivo estandarizado para CECH: La adhesión celular con ambos los métodos fue comparable en el modelo ex vivo e in vivo, con restauración de la transparencia corneal en los animales. Conclusiones: Se ha demostrado el potencial de varios inhibidores de ROCK, en particular el AR-13324, para estrategias de terapia celular o regeneración inducida farmacológicamente en el tratamiento de enfermedades endoteliales de la córnea. Los resultados sugieren que AR-13324 podría servir como un candidato prometedor para el tratamiento regenerativo de enfermedades endoteliales corneales. Tambíen observamos que los procedimientos de cultivo estandardizados ofrecen un enfoque viable para obtener cultivos funcionales de CECH a partir de córneas de donantes de edad avanzada, lo que proporciona una posible fuente de células para trasplantes. Además, ambos métodos de inyección de CECH cultivadas fueron capaces de revertir la disfunción endotelial en conejos. Estos resultados tienen importantes implicaciones en los campos de la oftalmología, el trasplante corneal y la medicina regenerativa.