Avaliação histológica, ultraestrutural e molecular de córneas com ceratocone e dos efeitos do crosslinking rápido sobre os ceratócitos cultivados em modelo 3D
Data
2021
Autores
Covre, Joyce Luciana 
Orientadores
Gomes, Jose Alvaro Pereira
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
Purpose: Characterize healthy and keratoconus human corneas and keratocytes using histochemical, ultrastructural and molecular analysis and to evaluate the effects of crosslinking treatment at different times on healthy and KC keratocytes cultured in the 3D model. Methods: Cornea samples from control and KC patients were collected and processed for histological, biochemical, immunohistochemical and ultrastructural analyses. Primary keratocytes from control and KC corneas were isolated by collagenase digestion and cultured in DMEM/Ham\'s F12 medium supplemented with 2 % fetal bovine serum. After these cells reach the confluence state (~30 days), they were processed for Western blot analysis to evaluate protein levels implicated in cell structure, adhesion and signaling and an analysis of the lipid profile was performed. Cultured keratocytes were also subjected to CXL treatment at different times. After 24 hours viable cells were quantified by MTT and LDH techniques and apoptotic cells were counted using the caspase 3 marker. The levels of pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 and MMP-3, MMP-9 from the supernatants were tested by an enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). Results: Histological analysis showed that stroma from KC corneas presented disorganized collagen fibers compared to control samples. Picrosirius-polarization analysis demonstrated enhanced birefringence of collagen networks from control corneas compared to KC. Densitometry of yellow-red/ green birefringence of collagen fibers confirmed these findings and indicates a loss of collagen alignment in the KC. Ultrastructural analysis of KC cornea demonstrated loose fibrillar networks of stroma with small and thin collagen fibril diameters compared to the control samples. In addition, cultured KC cells showed reduced levels of vimentin, focal adhesion kinase (FAK), β1-integrin, keratocan and the activation of Src tyrosine. By contrast, lumican levels were increased in the KC cells and in the corneal stroma. In the analysis of the lipid profile, the potential biomarkers were shown to be completely different in cells with keratoconus compared to control cells (normal). After 24 hours of treatment with CXL, cell viability assessed by MTT and LDH assays indicated that there were no significant changes in the healthy and keratoconus groups. On the other hand, the immunofluorescence analysis showed increased levels of caspase 3 cleaved in healthy cells and keratoconus after 24 hours of treatment with CXL for 30 minutes. The quantification of the levels of pro-inflammatory cytokines IL- 8 and IL-6 and MMP-3 and -9 did not change. Conclusion: Our findings provide that KC is associated with a marked alteration of structural and molecular patterns of corneal stroma and keratocytes. This may be of significance for explanation of pathogenesis of corneal ectactic diseases.
Objetivo: Caracterizar córneas e ceratócitos humano saudáveis (controle) e com ceratocone utilizando técnicas de análise histoquímica, ultraestrutural e molecular e avaliar os efeitos do tratamento de crosslinking em diferentes momentos em ceratócitos saudáveis e ceratócitos com ceratocone cultivados em modelo 3D. Métodos: Amostras de córnea de pacientes saudáveis e com ceratocone foram coletadas e processadas para análises histológicas, bioquímicas, imunohistoquímicas e ultraestruturais. Ceratócitos primários de córneas humanas saudáveis (controle) e com ceratocone foram isolados por digestão com colagenase e cultivadas em meio DMEM / Ham's F12 suplementado com 2% de soro fetal bovino. Após essas células atingirem o estado de confluência (~ 30 dias), elas foram processadas para análise de Western blot para avaliar os níveis de proteína implicados na estrutura celular, adesão e sinalização. Análise do perfil lipídico também foi realizada. Os ceratócitos cultivados foram submetidos ao tratamento CXL em diferentes momentos e após 24 horas as células viáveis foram quantificadas pelas técnicas de MTT e LDH e as células apoptóticas pelo marcador de caspase 3. Dos sobrenadantes foram testados por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) os níveis de citocinas pró-inflamatórias IL-6 e IL-8 e MMP-3 e MMP-9. Resultados: A análise histológica mostrou que o estroma das córneas com ceratocone apresenta fibras de colágeno desorganizadas em comparação com as amostras controle. A análise de picrosirius-polarization demonstrou birrefringência aumentada de redes de colágeno de córneas de controle em comparação com ceratocone. A densitometria da birrefringência amarelovermelho / verde das fibras de colágeno confirmou esses achados e indica uma perda do alinhamento do colágeno no ceratocone. A análise ultraestrutural da córnea com ceratocone demonstrou redes fibrilares soltas de estroma com diâmetros de fibrilas de colágeno pequenos e finos em comparação com as amostras de controle. Além disso, as células com ceratocone apresentaram níveis reduzidos de vimentina, quinase de adesão focal (FAK), integrina β1, keratocan e ativação da tirosina Src. Em contraste, os níveis de lumican foram aumentados nas células com ceratocone e no estroma corneal. Na análise do perfil lipídico, os potenciais biomarcadores demonstraram-se completamente diferentes nas células com ceratocone em comparação com as células controle (normais). Após 24 horas de tratamento com CXL, a viabilidade celular avaliada por ensaios de MTT e LDH indicaram que não houve alterações significativas nos grupos saudáveis e ceratocone. Por outro lado, a análise de imunofluorescência mostrou níveis aumentados de caspase 3 clivada nas células saudáveis e de ceratocone após 24 horas de tratamento com CXL de 30 minutos. A quantificação dos níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-8 e IL-6 e das MMP-3 e MMP-9 não apresentaram alterações. Conclusão: Nossos resultados indicam que o ceratocone está associado a uma alteração acentuada dos padrões estruturais e moleculares do estroma corneal e dos ceratócitos. Esses achados podem ser importantes para o entendimento da patogênese das ectasias corneais.
Objetivo: Caracterizar córneas e ceratócitos humano saudáveis (controle) e com ceratocone utilizando técnicas de análise histoquímica, ultraestrutural e molecular e avaliar os efeitos do tratamento de crosslinking em diferentes momentos em ceratócitos saudáveis e ceratócitos com ceratocone cultivados em modelo 3D. Métodos: Amostras de córnea de pacientes saudáveis e com ceratocone foram coletadas e processadas para análises histológicas, bioquímicas, imunohistoquímicas e ultraestruturais. Ceratócitos primários de córneas humanas saudáveis (controle) e com ceratocone foram isolados por digestão com colagenase e cultivadas em meio DMEM / Ham's F12 suplementado com 2% de soro fetal bovino. Após essas células atingirem o estado de confluência (~ 30 dias), elas foram processadas para análise de Western blot para avaliar os níveis de proteína implicados na estrutura celular, adesão e sinalização. Análise do perfil lipídico também foi realizada. Os ceratócitos cultivados foram submetidos ao tratamento CXL em diferentes momentos e após 24 horas as células viáveis foram quantificadas pelas técnicas de MTT e LDH e as células apoptóticas pelo marcador de caspase 3. Dos sobrenadantes foram testados por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) os níveis de citocinas pró-inflamatórias IL-6 e IL-8 e MMP-3 e MMP-9. Resultados: A análise histológica mostrou que o estroma das córneas com ceratocone apresenta fibras de colágeno desorganizadas em comparação com as amostras controle. A análise de picrosirius-polarization demonstrou birrefringência aumentada de redes de colágeno de córneas de controle em comparação com ceratocone. A densitometria da birrefringência amarelovermelho / verde das fibras de colágeno confirmou esses achados e indica uma perda do alinhamento do colágeno no ceratocone. A análise ultraestrutural da córnea com ceratocone demonstrou redes fibrilares soltas de estroma com diâmetros de fibrilas de colágeno pequenos e finos em comparação com as amostras de controle. Além disso, as células com ceratocone apresentaram níveis reduzidos de vimentina, quinase de adesão focal (FAK), integrina β1, keratocan e ativação da tirosina Src. Em contraste, os níveis de lumican foram aumentados nas células com ceratocone e no estroma corneal. Na análise do perfil lipídico, os potenciais biomarcadores demonstraram-se completamente diferentes nas células com ceratocone em comparação com as células controle (normais). Após 24 horas de tratamento com CXL, a viabilidade celular avaliada por ensaios de MTT e LDH indicaram que não houve alterações significativas nos grupos saudáveis e ceratocone. Por outro lado, a análise de imunofluorescência mostrou níveis aumentados de caspase 3 clivada nas células saudáveis e de ceratocone após 24 horas de tratamento com CXL de 30 minutos. A quantificação dos níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-8 e IL-6 e das MMP-3 e MMP-9 não apresentaram alterações. Conclusão: Nossos resultados indicam que o ceratocone está associado a uma alteração acentuada dos padrões estruturais e moleculares do estroma corneal e dos ceratócitos. Esses achados podem ser importantes para o entendimento da patogênese das ectasias corneais.