Expressão heteróloga, purificação e estudo de efeitos da rSculptina na coagulação sanguínea

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Data
2021
Autores
Viana, Juliana Da Silva [UNIFESP]
Orientadores
Tavassi, Ana Marisa Chudzinski [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Objective: To investigate the action of recombinant Sculptin as an anticoagulant and a inhibition of thrombin-induced platelet activation. Methods: E. coli strain BL21 (DE3) containing plasmid Sculptin-Pet28a was cultivated with IPTG induction. After expression, the culture was lysed and the supernatant subjected to affinity chromatography, another ion exchange and finally gel filtration. The purified protein profile was monitored during these steps using SDS-Page. Blood clotting time, partially activated thromboplastin time (aPTT), prothrombin time (PT) and thrombin time (TT) assays were evaluated in the presence of rSculptin using diagnostic kits. The evaluation of the effect of rSculptin on platelets was performed in a platelet aggregation assay. Furthermore, the action of the recombinant protein was evaluated ex vivo with aPTT and PT assays after animal treatment. Finally, an in vivo bleeding time test was performed. Results: The purified protein showed activity on aPTT, PT and TT evaluated in vitro, extending them in a dose response, but with greater sensitivity for TT. It also inhibited platelet aggregation when thrombin was used as an agonist. Furthermore, when rSculptin was administered to animals at a concentration of 1 mg/kg, it significantly prolonged the clotting time of the plasmas evaluated in the aPTT and PT assays, the same was not observed for the concentration of 0.1 mg/kg. Finally, in the preliminary in vivo bleeding time assay, the studied protein prolonged the clotting time of treated animals at the concentration evaluated (1 mg/kg). Conclusion: The results obtained demonstrate that rSculptin has action on the clotting times evaluated in animal plasma. Furthermore, the essays shows the maintenance of the biological activity of this protein on blood clotting after it been administered to animals. Although preliminary, the results obtained in the assessment of bleeding time suggest an anticoagulant potential of rSculptin in vivo.
Objetivo: Investigar a ação da Sculptina recombinante quanto ao seu potencial anticoagulante e de inibição da agregação plaquetária mediante a trombina. Métodos: Cultura da cepa de E. coli BL21 (DE3) contendo o plasmídeo Sculptina-Pet28a, sobre a indução de IPTG. Após a expressão, a cultura foi lisada e o sobrenadante submetido a uma cromatografia de afinidade, outra de troca iônica e por fim gel filtração. O perfil da proteína purificada foi monitorado durante essas etapas através de SDS-Page. Os ensaios de tempo de coagulação sanguínea, tempo de tromboplastina parcialmente ativada (TTPa), tempo de protrombina (TP) e tempo de trombina (TT), foram avaliados na presença da rSculptina através da utilização de kits de diagnóstico. A avaliação do efeito da rSculptina sobre as plaquetas foi realizada em um ensaio de agregação plaquetária. Além disso, a ação da proteína recombinante foi avaliada ex vivo com ensaios de TTPa e TP após tratamento dos animais. Por fim foi realizado um ensaio de tempo sangramento in vivo. Resultados: A proteína purificada demonstrou atividade sobre os tempos de coagulação TTPa, TP e TT avaliados in vitro, prolongando os mesmos em uma dose resposta, mas com maior sensibilidade para o TT. A mesma também inibiu a agregação plaquetária, quando utilizado a trombina como agonista. Além disso, a rSculptina quando administrada aos animais na concentração de 1 mg/kg prolongou significativamente o tempo de coagulação dos plasmas avaliados nos ensaios de TTPa, TP, o mesmo não foi observado para a concentração de 0,1 mg/kg. Finalmente, no ensaio preliminar de tempo de sangramento in vivo a proteína estudada prolongou o tempo de coagulação dos animais tratados na concentração avaliada (1 mg/kg). Conclusão: Os resultados obtidos, demonstram que a rSculptina possui ação sobre os tempos de coagulação avaliados em plasma animal. Além disso, esses apontam a manutenção da atividade biológica dessa proteína sobre a coagulação sanguínea quando administrada em animais. Mesmo sendo preliminares, os resultados obtidos na avaliação do tempo de sangramento insinuam um potencial anticoagulante da rSculptina in vivo.
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