Efeitos do flavonoide luteolina na sinalização redox de células do endotélio venoso de ratos

Imagem de Miniatura
Data
2021
Autores
Assunção, Henrique Charlanti Reis [UNIFESP]
Orientadores
Fernandes, Liliam [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
The endothelium plays an essential role in vascular physiology, acting through a series of vasorelaxants substances such as nitric oxide (NO• ), and vasoconstrictors substances, such as the reactive oxygen species (ROS) radical superoxide (O2 •− ). In the vascular system, the main mechanism of O2 •− is to decrease in the bioavailability of NO• , through the chemical reaction between the two species. The product of this reaction is the peroxynitrite anion (ONOO¯), which can promote molecular changes such as protein nitration. The imbalance between these and other redox species is known as oxidative stress, harmful to the organism. Because of this antioxidant substances such as flavonoids can be beneficial in helping the organism to regulate this imbalance. Redox signaling is still poorly understood in the venous endothelium, an environment little studied in general. This work aimed to evaluate the action of the flavonoid luteolin in the redox signaling of rat vena cava endothelial cells, specifically the production of NO• , ROS and nitrotyrosine residues. To do so, immortalized cultures of endothelium previously established by our group were used. The evaluation of cytotoxicity was performed using the automated cell counter LUNA-FLTM, which demonstrated the absence of cytotoxic effects at the three studied concentrations [10, 20 and 50 μmol/L]. Experiments done in confocal microscopy with fluorescent probes demonstrated that luteolin was able to promote in 10 min a consistent increase in NO• production and a significant reduction in ROS by venous endothelial cells, in the three concentrations studied. NO• production was also measured in a spectrofluorometer, where 10 min of exposure to 50 μmol/L of luteolin induced an increase in NO• generation compared to basal, an effect not observed in lower concentrations. Also in spectrofluorometer, it was observed that exposure to luteolin for 24 h was able to significantly reduce the production of ROS in relation to basal, with effects comparable to TEMPOL, mimetic of the endogenous enzyme with antioxidant activity, superoxide dismutase. The presence of nitrated tyrosine residues was determined by immunofluorescence assays and demonstrated that exposure to luteolin for 10 min was able to significantly reduce the presence of nitrotyrosine residues, in the three concentrations studied, without differences between groups. In conclusion, luteolin is effective in reducing ROS and increasing the bioavailability of NO• in venous endothelium culture. In addition, these results also suggest that this change may decrease the amount of nitrated proteins, decreasing the impact of this type of molecular change. These findings indicate a possible future application of this flavonoid as a protective agent, improving endothelial function in several circulatory disorders related to venous insufficiency.
O endotélio desempenha um papel essencial na fisiologia vascular, atuando através de uma série de substâncias vasorelaxantes como o óxido nítrico (NO• ), e vasoconstritoras, como a espécie reativa de oxigênio (ERO) radical ânion superóxido (O2 •− ). No sistema vascular, o principal mecanismo do O2 •− é a diminuição da biodisponibilidade do NO• , através da reação química entre as duas espécies. O produto dessa reação é o ânion peroxinitrito (ONOO¯), que é capaz de promover alterações moleculares como a nitração de proteínas. O desequilíbrio entre essas e outras espécies redox é conhecido como estresse oxidativo, danoso ao organismo. Por conta disso substâncias antioxidantes como os flavonoides podem ser benéficos para auxiliar o organismo a regular esse desequilíbrio. A sinalização redox ainda é pouco compreendida no endotélio venoso, um ambiente pouco estudado no geral. Este trabalho teve como objetivo avaliar a ação do flavonoide luteolina na sinalização redox de células endoteliais de veia cava de ratos, especificamente a produção de NO• , ERO e resíduos de nitrotirosinas. Para isso foram utilizadas culturas imortalizadas de endotélio previamente estabelecidas por nosso grupo. A avaliação da citotoxicidade foi realizada utilizando-se o contador de células automatizado LUNA-FLTM, que demonstrou ausência de efeitos citotóxicos nas três concentrações estudadas [10, 20 e 50 μmol/L]. Experimentos realizados em microscopia confocal com sondas fluorescentes demonstraram que a luteolina foi capaz de promover em 10 min um aumento consistente na produção de NO• e uma redução significativa de ERO pelas células endoteliais venosas, nas três concentrações estudadas. A produção de NO• também foi medida em espectrofluorímetro, onde 10 min de exposição a 50 μmol/L de luteolina induziu um aumento na geração de NO• em relação ao basal, efeito não observado nas concentrações menores. Também em espectrofluorímetro, foi observado que a exposição a luteolina por 24 h foi capaz de reduzir significativamente a produção de ERO em relação ao basal, com efeitos comparáveis ao TEMPOL, mimético da enzima endógena com atividade antioxidante, superóxido dismutase. A presença de resíduos de tirosinas nitrados foi determinada a partir de ensaios de imunofluorescência, e demonstraram que a exposição a luteolina por 10 min foi capaz de reduzir a presença de resíduos de nitrotirosinas, nas três concentrações estudadas, sem diferenças entre os grupos. Conclui-se que a luteolina é eficaz na redução de ERO e aumento na biodisponibilidade de NO• em cultura endotélio venoso. Além disso, esses resultados também sugerem que essa alteração pode diminuir a quantidade de proteínas nitradas, diminuindo o impacto desse tipo de alteração molecular. Esses achados indicam uma possível futura aplicação desse flavonoide como agente protetor, melhorando a função endotelial em diversos distúrbios circulatórios relacionados à insuficiência venosa.
Descrição
Citação