Angioedema Hereditário: desenvolvimento de um método de diagnóstico molecular baseado no gene SERPING1 e de um modelo celular in vitro da barreira hematoencefálica

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Data
2022-12-19
Autores
Amorim, Priscila Nicolicht de [UNIFESP]
Orientadores
Porcionatto, Marimélia Aparecida [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Introdução: O angioedema hereditário é uma doença genética decorrente de variantes patogênicas no gene SERPING1, que codifica o inibidor de C1 esterase, cuja prevalência mundial estimada é de 1:50.000 a 1:100.000. A deficiência do inibidor de C1 esterase causa exacerbação das cascatas do complemento, fibrinolítica, da coagulação e das calicreínas-cininas e aumento da produção de mediadores inflamatórios, principalmente bradicinina, pela ação da enzima calicreína plasmática. O aumento de bradicinina ocasiona vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular levando ao extravasamento de fluído dos vasos para os tecidos, causando edema. O angioedema hereditário é caracterizado clinicamente por episódios recorrentes de edema local ou generalizado, além de oferecer risco de morte por asfixia. Apesar da generalização da ocorrência de edema, o sistema nervoso central parece ser um local protegido, pois os episódios de edema cerebral são raros ou inexistentes no angioedema hereditário. Com base nesse fenômeno, nossa hipótese é que as células endoteliais da microvasculatura cerebral expressem um inibidor da calicreína plasmática, impedindo a geração de bradicinina no local. Objetivos: Os objetivos desta tese foram i) desenvolver um método para detectar grandes deleções e inserções no gene SERPING1 para o diagnóstico de angioedema hereditário e, ii) estabelecer um protocolo simplificado com alto rendimento celular para o isolamento e purificação de células endoteliais da microvasculatura cerebral de camundongo neonato. Métodos: i) A Técnica de Quantificação de Éxons (TQE) foi desenvolvida utilizando o DNA total extraído de sangue de pacientes de duas famílias brasileiras com histórico clínico de angioedema hereditário, baixos níveis plasmáticos de C4 e C1-INH e nenhuma alteração patogênica em SERPING1 analisada por sequenciamento de Sanger; ii) Descrevemos um protocolo simplificado usando camundongos recém-nascidos C57BL/6 no dia pós-natal (P1) para isolar, purificar e cultivar monocamadas de células endoteliais da microvasculatura cerebral em dois substratos diferentes (lamínulas e insertos). Resultados: i) O uso da TQE permitiu detectar duas grandes deleções diferentes no éxon 4, uma de 1356 pb e outra de 1804 pb, que resultaram da recombinação de dois elementos Alu presentes nos íntrons 3 e 4 do gene SERPING1, ii) Testamos a função de células endoteliais da microvasculatura cerebral usando um modelo de privação de oxigênio-glicose. A caracterização e validação in vitro da cultura primária das células endoteliais incluiu microscopia de luz, imunomarcação e análise do perfil de expressão gênica. A medida da resistência elétrica transendotelial (TEER) foi usada como um ensaio funcional dos complexos de junção aderente. Conclusão: Com o desenvolvimento e utilização da técnica de quantificação de éxons foi possível estabelecer o diagnóstico molecular de duas famílias afetadas com o angioedema hereditário. Além disso, estabelecemos um modelo in vitro da barreira hematoencefálica que poderá ser utilizado para testar a hipótese da existência de um possível inibidor da calicreína plasmática expresso localmente nas células endoteliais da microvasculatura cerebral. A caracterização desse inibidor poderá ser um passo importante para o conhecimento e desenvolvimento de novas terapias para o tratamento do angioedema hereditário, para doenças neurológicas e neurodegenerativas.
Introduction: Hereditary angioedema is a genetic disease resulting from pathogenic variants in the SERPING1 gene, which encodes the C1 esterase inhibitor whose estimated worldwide prevalence is 1:50,000 to 1:100,000. C1 esterase inhibitor deficiency causes exacerbation of complement, fibrinolytic, coagulation and kallikrene-kinin cascades and increased production of inflammatory mediators, mainly bradykinin, through the action of plasma kallikrein. The increase in bradykinin causes vasodilation and increased vascular permeability leading to leakage of fluid from the vessels into the tissues, causing edema. Hereditary angioedema is clinically characterized by recurrent episodes of local or generalized edema, in addition to being life-threatening by asphyxia. Despite the generalized occurrence of edema, the central nervous system appears to be a protected site, as episodes of cerebral edema are rare or non-existent in hereditary angioedema. Based on this phenomenon, our hypothesis is that the endothelial cells of the brain microvasculature express an inhibitor of plasma kallikrein, preventing the generation of bradykinin at the site. Objectives: The objectives of this thesis were i) to develop a method and detect large deletions and insertions in the SERPING1 gene for the diagnosis of hereditary angioedema and, ii) to establish a simplified protocol with high cell throughput for the isolation and purification of endothelial cells from the brain microvasculature of newborn mouse. Methods: i) The Exon Quantification Technique (EQT) was developed using the total DNA extracted from the blood of patients from two Brazilian families with a clinical history of hereditary angioedema, low plasma levels of C4 and C1-INH and no pathogenic alteration in SERPING1 analyzed by Sanger sequencing; ii) We describe a simplified protocol using postnatal day (P1) C57BL/6 newborn mice to isolate, purify and culture brain microvasculature endothelial cell monolayers on two different substrates (coverslips and inserts). Results: i) By using EQT two different large deletions could be found in exon 4, one of 1356 bp and the other of 1804 bp, which resulted from the recombination of two Alu elements present in introns 3 and 4 of the SERPING1 gene, ii) We tested the function of endothelial cells of the cerebral microvasculature using a model of oxygen-glucose deprivation. The characterization and in vitro validation of the primary culture of endothelial cells included light microscopy, immunostaining and analysis of the gene expression profile. The measurement of transendothelial electrical resistance (TEER) was used as a functional assay of adherent junction complexes. Conclusion: With the development and use of the exon quantification technique, it was possible to establish the molecular diagnosis of two families affected with hereditary angioedema. Furthermore, we established an in vitro model of the blood-brain barrier that can be used to test the hypothesis of the existence of a possible plasma kallikrein inhibitor expressed locally in the endothelial cells of the brain microvasculature. The characterization of this inhibitor could be an important step towards the knowledge and development of new therapies for the treatment of both hereditary angioedema and neurological and neurodegenerative diseases.
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