Nanopartículas de Ouro Ultrapequenas Alteram a Formação do coágulo de Fibrina

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Data
2023-01-30
Autores
Paixão, Natasha Adriana Mina de Souza [UNIFESP]
Orientadores
Sousa, Alioscka Augusto [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Nanopartículas de ouro ultrapequenas (usNPs; < 3 nm) constituem uma importante e promissora plataforma para estudos em pesquisa clínica e básica, devido a apresentarem características físico-químicas semelhantes a proteínas, ausência de efeitos tóxicos in vivo em animais, e capacidade de remoção do sangue pela urina. Apesar do grande potencial das usNPs e ampla investigação nos últimos anos visando aplicações em nanomedicina, existem poucos estudos de base in vitro para uma maior compreensão das interações dessas partículas com proteínas e seus efeitos em vias bioquímicas complexas, como a coagulação e inflamação. Em trabalho publicado recentemente, observamos que usNPs aniônicas de 2 nm de diâmetro passivadas com ácido 4-mercaptobenzoico (AuMBA) prolongaram o tempo de coagulação em amostras de plasma humano in vitro. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi compreender os mecanismos moleculares pelos quais o AuMBA desempenha seu efeito anticoagulante. Ao mesmo tempo, buscamos caracterizar aspectos do coágulo formado na presença das partículas, como permeabilidade e resistência à degradação enzimática. AuMBA foi sintetizado e caracterizado por espectrometria UV-visível, ultracentrifugação analítica (AUC), espalhamento de luz e potencial zeta. As interações do AuMBA com fibrinogênio purificado foram caracterizadas por espectroscopia de fluorescência, dicroísmo circular e AUC. Ensaios em leitor de placa e em um coagulômetro foram realizados para acompanhar a cinética de formação e degradação do coágulo a partir de amostras de plasma humano e fibrinogênio purificado, na ausência ou presença de AuMBA. Foi avaliada também a permeabilidade do coágulo formado na presença de AuMBA, bem como o aprisionamento das partículas no interior do coágulo. Principais resultados encontrados: (i) AuMBA interagiu com fibrinogênio purificado. (ii) AuMBA prolongou a formação do coágulo nas amostras testadas. (iii) AuMBA não interferiu na cinética de geração de trombina e não interagiu com trombina na presença de fibrinogênio ou plasma em excesso. (iv) Em conjunto, os resultados (i-iii) sugeriram que interações com o fibrinogênio constituem o principal mecanismo responsável pelo prolongamento do tempo de coagulação por AuMBA. (v) O coágulo formado na presença do AuMBA apresentou maior permeabilidade. (vi) AuMBA permaneceu aprisionado no coágulo. (vii) Coágulos formados na presença de AuMBA apresentaram maior tempo de degradação por plasmina. Nossos estudos sugerem que um exame detalhado da cinética de formação, estrutura e propriedade dos coágulos de fibrina faça parte da rotina de caracterização da biocompatibilidade dos nanomateriais.
Ultrasmall gold nanoparticles (usNPs; < 3 nm) constitute an important and promising platform for studies in clinical and basic research, due to their physicochemical characteristics similar to proteins, absence of in vivo toxic effects in animals, and ability to be cleared from circulation through the urine. Recently, we showed that anionic usNPs of 2 nm in diameter and passivated with 4-mercaptobenzoic acid prolonged clot formation in human plasma in vitro. Thus, the objective of the present work was to understand the molecular mechanisms by which AuMBA performs its anticoagulant effect. At the same time, we sought to characterize aspects of the fibrin clot in the presence of AuMBA, such as permeability and resistance to lysis. AuMBA was synthesized and characterized by UV-visible spectroscopy, analytical ultracentrifugation (AUC), light scattering and zeta potential measurements. Interactions of AuMBA with purified fibrinogen were characterized by fluorescence spectroscopy, circular dichroism and AUC. Experiments were performed on a plate reader and coagulometer to follow the kinetics of clot formation and fibrinolysis from human plasma samples and purified fibrinogen, both in the absence and presence of AuMBA. Permeability measurements of the fibrin clot were also performed, in addition to measurements of particle diffusion out of the clot. Main findings of our work include: (i) AuMBA interacted with purified fibrinogen. (ii) AuMBA prolonged clot formation in the tested samples. (iii) AuMBA did not interfere with the kinetics of thrombin generation and did not interact with thrombin in the presence of excess fibrinogen or plasma. (iv) Taken together, results (i-iii) suggested that direct interactions with fibrinogen constitute the main mechanism by which AuMBA prolongs clot formation. (v) Clots formed in the presence of AuMBA had higher permeability. (vi) AuMBA remained trapped within the clot. (vii) Clots formed in the presence of AuMBA showed a longer degradation time by plasmin. Taken together, our results suggest that a detailed analysis of the kinetics of clot formation, clot structure and properties should be part of the routine assessment of nanomaterial biocompatibility.
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PAIXÃO, Natasha Adriana Mina de Souza. Nanopartículas de ouro ultrapequenas alteram a formação do coágulo de fibrina. Orientador: Alioscka Sousa. 2023. 61 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biologia Molecular), Bioquímica, Universidade Federal de São Paulo, Repositório Institucional Universidade Federal de São Paulo, 2023.