Identificação molecular de espécies crípticas e raras de leveduras isoladas de amostras clínicas provenientes de centros médicos da América Latina

Identificação molecular de espécies crípticas e raras de leveduras isoladas de amostras clínicas provenientes de centros médicos da América Latina

Alternative title Molecular identification of cryptic and rare yeast species isolated from clinical samples from medical centers from Latin America.
Author Luiz, Bruno Ribeiro Google Scholar
Advisor Melo, Analy Salles de Azevedo Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Medicina Translacional
Abstract Introdução: As infecções de corrente sanguínea (ICS) causadas por leveduras têm se tornado um importante problema de saúde pública em hospitais terciários de todo mundo, apresentando mortalidade na ordem de 50%, o que torna esta infecção um grande problema para os clínicos e hospitais terciários de diferentes países. Os casos de fungemias nosocomiais são em sua grande maioria causados por 3 gêneros de leveduras: Candida, Trichosporon e Cryptococcus. Dentre estes gêneros, as espécies de Candida são as mais frequentemente encontradas em infecções de corrente sanguínea. Estudos têm demonstrado que 90% ou mais dos casos de candidemia são atribuídos a apenas cinco espécies: C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis sensu lato, C. glabrata e C. krusei. Entretanto, com os avanços dos métodos moleculares de identificação, espécies mais raras ou crípticas, como aquelas pertencentes a complexo de espécies têm sido cada vez mais frequentemente identificadas como causa de candidemia. Objetivos: Considerando a escassez de dados epidemiológicos sobre a prevalência das espécies crípticas e raras de leveduras em infecções fúngicas invasivas (IFI), e a dificuldade da identificação destas espécies por métodos fenotípicos convencionais, este estudo teve como objetivo geral identificar por método molecular, as espécies crípticas e raras de leveduras provenientes de diferentes centros médicos da América Latina e determinar a ocorrência destas espécies nestes centros médicos. Material e métodos: Foram selecionados isolados de leveduras responsáveis por IFIs provenientes de centros médicos da América Latina depositados no Banco de Micro-organismos do Laboratório Especial de Micologia (LEMI) EPM/UNIFESP ao longo do período de 2008 a 2018, previamente identificadas por métodos fenotípicos como leveduras de espécies raras ou crípticas. Estes isolados foram repicados em ágar Sabouraud Dextrose (SDA) e CHROMagar Candida para verificação de viabilidade e pureza. Para a identificação molecular foi realizado sequenciamento da região ITS do gene ribossomal (DNAr),utilizando-se a metodologia de Sanger. As sequências obtidas foram analisadas no programa Sequencher verção 4.1.4 para a obtenção das sequências consenso. Os contigs de alta qualidade foram comparados com aqueles depositadas nos bancos genômicos NCBI e ISHAM-ITS Database para a identificação da espécie. Resultados: Cem isolados clínicos de leveduras de espécies raras ou crípticas responsáveis por IFI, provenientes de 21 centros médicos da América Latina, coletadas durante o período de 2008 e 2018, que puderam ser reativados a partir do Banco de micro-organismos do LEMI e apresentaram culturas puras foram incluídos neste estudo. Realizou-se a comparação entre a acurácia da identificação fenotípica e genotípica. Na comparação entre a identificação fenotípica e molecular, houve concordância em 64% dos isolados, considerando correta a identificação das leveduras classificadas como pertencentes a complexos do gênero. As espécies que apresentaram alguma concordância foram Candida krusei (25 de 28), Candida lusitaniae (12 de 14), Candida pelicullosa (7 de 9), Rhodotorula mucilaginosa (5 de 5), Candida kefyr (3 de 5), Candida intermedia (1 de 3), Saccharomyces cerevisiae (1 de 2) e Candida nivariensis (1 de 1) do complexo Candida glabrata. Foi possível observar que a discrepância de 36% ocorreu principalmente com as espécies mais raras de leveduras como patógenos humanos, como: Candida fabianii, Candida pararugosa, Debaryomyces nepalensis, Pichia kluyveri e Pichia farinosa. Este fato pode ser justificado pela limitação do banco de dados dos testes fenotípicos utilizados na identificação destas leveduras. Conclusões: Os métodos fenotípicos foram capazes de identificar corretamente somente 64% das espécies crípticas e raras estudadas. O método de sequenciamento de ITS, considerado padrão ouro para a identificação de leveduras, permitiu a identificação de todos os isolados deste estudo com acurácia. Foi possível identificar a ocorrência de infecções fúngicas por espécies crípticas e raras em pacientes de centros médicos brasileiros e da América Latina, nunca antes descritas na literatura.

Introduction: Bloodstream infections (BSI) caused by yeasts have become a major public health problem in tertiary hospitals around the world, with a mortality rate of 50%, making this infection a major problem for clinicians and tertiary hospitals from different countries. Most cases of nosocomial fungemias are caused by 3 yeast genera: Candida, Trichosporon and Cryptococcus. Among these genera, Candida species are the most frequently found in bloodstream infections. Studies have shown that 90% or more of candidemia cases are attributed to only five species: C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis sensu lato, C. glabrata and C. krusei. However, with advances in molecular identification methods, rare or cryptic species such as species belonging to the species complex have been increasingly identified as cause of candidemia. Objectives: Considering the scarcity of epidemiological data on the prevalence of cryptic and rare yeast species in invasive fungal infections (IFI), and the difficulty of identification of these species by conventional phenotypic methods, this study aimed to identify by molecular method cryptic and rare yeast species from different medical centers in Latin America and to determine their occurrence in these centers. Materials and methods: Yeast isolates from IFI from Latin American medical centers, deposited in the Microorganisms Bank of the Special Laboratory of Mycology (LEMI) EPM / UNIFESP from 2008 to 2018, previously identified by phenotypic methods as rare or cryptic species were selected. These isolates were seeded on Sabouraud Dextrose Agar (SDA) and CHROMagar Candida for viability and purity evaluation. For molecular identification, ITS region sequencing of the ribosomal gene (rDNA) was performed using the Sanger methodology. The DNA sequences were analyzed in the Sequencher ver. 4.1.4 program to obtain the consensus sequences. High quality contigs were compared with those deposited in the NCBI and ISHAM-ITS genomic databases for species identification. Results: One hundred clinical isolates of rare or cryptic yeast species responsible for IFI from 21 Latin American medical centers, collected from 2008 to 2018, which could be reactivated from the LEMI Microorganisms Bank and presented pure cultures were included in this study. Comparison was made between the accuracy of phenotypic and genotypic identification, there was agreement in 64% of the isolates, considering correct the identification of yeasts that were phenotypically identified as belonging to species complex. Species that showed some agreement were Candida krusei (25 of 28), Candida lusitaniae (12 of 14), Candida pelicullosa (7 of 9), Rhodotorula mucilaginosa (5 of 5), Candida kefyr (3 of 5), Candida intermedia ( 1 of 3), Saccharomyces cerevisiae (1 of 2) and Candida nivariensis (1 of 1) of the Candida glabrata complex. It was observed 36% discrepancy that occurred mainly with the rare yeast species as human pathogens, such as Candida fabianii, Candida paraugosa, Debaryomyces nepalensis, Pichia kluyveri and Pichia farinosa. This fact may be justified by the limitation of the phenotypic tests databases used to identify these yeasts. Conclusions: Phenotypic methods were able to correctly identify only 64% of the cryptic and rare species studied. The ITS sequencing method, considered the gold standard for yeast identification, allowed the identification of all isolates of this study with accuracy. It was possible to identify the occurrence of fungal infections by cryptic and rare species in patients from Brazilian and Latin American medical centers, never described before in the literature.
Keywords Identificação molecular
Identificação fenotípica
Espécies crípticas de leveduras
Candida spp
xmlui.dri2xhtml.METS-1.0.item-coverage Unifesp Campus São Paulo
Language Portuguese
Sponsor Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Date 2019
Published in LUIZ, Bruno Ribeiro. Identificação molecular de espécies crípticas e raras de leveduras isoladas de amostras clínicas provenientes de centros médicos da América Latina. São Paulo, 2019. 86 p. Dissertação (Mestrado em Medicina Translacional) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2019.
Publisher Universidade Federal de São Paulo
Extent 86 p.
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/61323

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Name: Dissertação - v ... l - Bruno Ribeiro Luiz.pdf
Size: 1.504Mb
Format: PDF
Description: Dissertação completa
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