Avaliação da transmissão colinérgica na disfunção gastrintestinal associada à falta de distrofina em camundongos MDX
Data
2019-10-31
Autores
Ferraz, Miriele Cristina 
Orientadores
Souccar, Caden
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive, recessive and degenerative muscle disease caused by mutations of the dystrophin gene and a lack of the related protein in muscles and the central nervous system (CNS). In addition to the muscle wasting, patients with DMD present gastrointestinal disorders such as gastric dilatation, delayed gastric emptying, dysphagia, vomiting and intestinal pseudo-obstruction. Some of these patients also present cognitive deficits and neuropsychiatric disorders that have been related to dystrophin deficiency in the CNS. Previous studies by the group have indicated cholinergic and GABAergic synaptic dysfunctions associated with dystrophin deficiency in peripheral motor synapses and in brain regions involved in cognitive functions such as attention, learning and memory (hippocampus and cerebellum) in the mdx mouse model (Ghedini et al. (2008), Parames et al., 2014, Pereira da Silva et al., 2018). Considering the bi-directional communication between the CNS and the gastrointestinal tract (GIT), as well as their mutual influences through the brain-gut axis, this study was aimed to examine the cholinergic transmission in the gastrointestinal dysfunctions associated with dystrophin deficiency, seeking a possible relationship with the previously reported peripheral and central cholinergic synaptic dysfunctions. In vivo studies were performed using male control (C) and mdx mice (4 to 5 months old); in vitro assays were performed using isolated preparations from different intestinal regions of the same animal groups. The results obtained in vivo showed a reduced intestinal transit (39%) and delayed gastric emptying in mdx mice compared to control values. Spontaneous contractions recorded from isolated duodenum, ileum, proximal colon (PC) and distal colon (DC) preparations showed an increase (66%) in the amplitudes of the largest contractions in CD of mdx mice compared to controls. Concentration-response curves constructed to carbachol (CCh), before and after incubation of atropine (10-8 M), did not show significant differences in the maximum contractile effect (Emax) and the mean effective concentration (EC50) of the agonist between C and mdx preparations. In all preparations, activation of nAChRs by the agonist dimethylphenylpiperazine (DMPP) produced a concentration-related relaxation, but the maximal relaxation (Rmax) and EC50 values did not differ between C and mdx groups. Blockade of the enteric ganglia transmission by hexamethonium (300 μM) reduced the relaxation induced by low concentrations of DMPP (3 and 10 μM) in PC of control (80 to 59%) and mdx (83 to 51%) groups. However, all tested concentrations of DMPP (3-100 μM) reduced the agonist-induced relaxation in the DC from control (91-93%) and mdx (93-36%) groups. Neuronal blockade with tetrodotoxin (TTX, 1 μM) reduced the relaxation induced by low concentrations of DMPP in both PC and DC, indicating that the effect is partially neurogenic. Exposure to the nitric oxide synthase inhibitor (NOS), L-NAME (1 mM), did not affect the relaxation induced by 3 and 10 μM of DMPP in PC and DC of control mice, whereas the relaxation effect was potentiated by 30 and 100 μM of DMPP. In the mdx group, L-NAME increased the DMPP-induced relaxation in PC at the highest concentration (100 μM). Moreover, the relaxation responses induced by DMPP (30 and 100 μM) + L-NAME in PC were lower in mdx than in control mice. In conclusion, the data in vivo confirmed the decreased intestinal transit and delayed gastric emptying associated with dystrophin-deficiency, as described in patients with DMD. These changes were unrelated to a dysfunction of the excitatory cholinergic transmission in enteric neurons. The relaxation effect induced by nicotinic activation appears to involve the enteric non-cholinergic inhibitory pathways mediated, predominantly, by NO. Together, the data favor probable changes in the nitrergic transmission associated with dystrophin deficiency, which is consistent with the altered intestinal motility detected in vivo, as well as in the isolated colon of mdx mice. Nevertheless, a possible involvement of additional non-adrenergic non-cholinergic transmitters in the gastrointestinal dysfunctions, in mdx mice and patients, with DMD was not excluded.
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia degenerativa, recessiva e progressiva, causada por mutação do gene da distrofina e falta da expressão da proteína relacionada, em músculos e no sistema nervoso central (SNC). Além da fraqueza muscular, os pacientes com DMD apresentam distúrbios gastrintestinais como dilatação gástrica, retardo do esvaziamento gástrico, disfagia, vômitos e constipação intestinal. Parte dos pacientes apresenta também déficits cognitivos e transtornos neuropsiquiátricos atribuídos à falta da distrofina no SNC. Estudos anteriores do grupo indicaram alterações da função sináptica colinérgica e GABAérgica associadas à falta da distrofina, em sinapses motoras periféricas e em regiões encefálicas envolvidas em funções cognitivas como atenção, aprendizado e memória (hipocampo e cerebelo) no modelo do camundongo mdx (Ghedini e col., 2008, 2012; Parames e col., 2014; Pereira da Silva e col., 2018). Considerando a estreita conexão entre o SNC e o trato gastrintestinal (TGI), bem como as influências mútuas mediadas pelo eixo encéfalo-intestino (brain-gut axis), o objetivo deste trabalho foi avaliar a transmissão colinérgica na disfunção gastrintestinal associada à falta de distrofina e sua possível correlação com as alterações de sinapses colinérgicas, periféricas e centrais, descritas em nossos estudos anteriores. Foram realizados ensaios in vivo utilizando camundongos machos controles (C) e mdx, com 4 a 5 meses de idade, e estudos funcionais in vitro com preparações isoladas de intestino delgado e intestino grosso dos mesmos grupos animais. Os resultados obtidos in vivo mostraram redução significativa do trânsito intestinal (39%) e retardo do esvaziamento gástrico em camundongos mdx em relação aos valores controles. Os registros das contrações espontâneas obtidos de preparações isoladas de duodeno, íleo, cólon proximal (CP) e cólon distal (CD) mostraram aumento (66%) das amplitudes das contrações maiores no CD do grupo mdx em relação aos valores controles. As curvas concentração-resposta de carbacol (CCh) obtidas nas mesmas preparações, antes e após a incubação de atropina (10-8 M), não mostraram diferenças significativas dos valores do efeito máximo (Emax), ou da concentração efetiva (CE50) do agonista entre os grupos C e mdx. Em todas as preparações, a ativação dos receptores colinoceptivos nicotínicos (nAChRs) pelo agonista dimetilfenilpiperazina (DMPP) produziu relaxamento relacionado às concentrações, mas os valores do relaxamento máximo (Rmax) e CE50 determinados não diferiram entre os grupos C e mdx. Na presença de bloqueio da transmissão dos gânglios entéricos pelo hexametônio (300 μM), o relaxamento produzido pelas menores concentrações do DMPP (3 e 10 μM) foi significativamente reduzido no CP dos grupos C (80 a 59%) e mdx (83 a 51%). Nas mesmas condições, o efeito produzido por todas as concentrações do DMPP (3 a 100 μM) foi reduzido no CD dos grupos C (91 a 93%) e mdx (93 a 36%). O bloqueio da condução nervosa com tetrodotoxina (TTX, 1 μM) reduziu o relaxamento produzido pelas menores concentrações do DMPP no CP e no CD dos dois grupos animais, indicando que o efeito do agonista nicotínico é parcialmente neurogênico. A exposição das preparações de CP e CD do grupo controle ao L-NAME (1 mM), um inibidor da sintase do óxido nítrico (NOS), não afetou o relaxamento produzido por 3 e 10 μM do DMPP, mas potenciou o efeito produzido por 30 e 100 μM do agonista. No grupo mdx, o L-NAME potenciou o relaxamento produzido pela maior concentração do DMPP no CP, sem afetar as demais respostas do agonista no CP e no CD. Além disso, as respostas produzidas pelo DMPP (30 e 100 μM) + L-NAME no CP foram menores no grupo dos mdx em relação aos valores controles. Em conclusão, os resultados obtidos in vivo confirmaram a redução do trânsito intestinal e o retardo do esvaziamento gástrico associados à falta de distrofina e descritos em pacientes com DMD. Essas alterações não foram relacionadas à disfunção da transmissão colinérgica excitatória dos neurônios entéricos. O relaxamento produzido por ativação nicotínica parece envolver a transmissão das vias não colinérgicas inibitórias dos neurônios entéricos mediadas, principalmente, pelo NO. Em conjunto, os resultados apontam para prováveis alterações da transmissão nitrérgica associadas à falta da distrofina e compatíveis com as alterações de motilidade intestinal observadas in vivo e no cólon isolado do modelo mdx. Não foi excluída, porém, a possível participação de outros neurotransmissores não adrenérgicos não colinérgicos nas alterações gastrintestinais observadas no modelo mdx e na DMD.
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia degenerativa, recessiva e progressiva, causada por mutação do gene da distrofina e falta da expressão da proteína relacionada, em músculos e no sistema nervoso central (SNC). Além da fraqueza muscular, os pacientes com DMD apresentam distúrbios gastrintestinais como dilatação gástrica, retardo do esvaziamento gástrico, disfagia, vômitos e constipação intestinal. Parte dos pacientes apresenta também déficits cognitivos e transtornos neuropsiquiátricos atribuídos à falta da distrofina no SNC. Estudos anteriores do grupo indicaram alterações da função sináptica colinérgica e GABAérgica associadas à falta da distrofina, em sinapses motoras periféricas e em regiões encefálicas envolvidas em funções cognitivas como atenção, aprendizado e memória (hipocampo e cerebelo) no modelo do camundongo mdx (Ghedini e col., 2008, 2012; Parames e col., 2014; Pereira da Silva e col., 2018). Considerando a estreita conexão entre o SNC e o trato gastrintestinal (TGI), bem como as influências mútuas mediadas pelo eixo encéfalo-intestino (brain-gut axis), o objetivo deste trabalho foi avaliar a transmissão colinérgica na disfunção gastrintestinal associada à falta de distrofina e sua possível correlação com as alterações de sinapses colinérgicas, periféricas e centrais, descritas em nossos estudos anteriores. Foram realizados ensaios in vivo utilizando camundongos machos controles (C) e mdx, com 4 a 5 meses de idade, e estudos funcionais in vitro com preparações isoladas de intestino delgado e intestino grosso dos mesmos grupos animais. Os resultados obtidos in vivo mostraram redução significativa do trânsito intestinal (39%) e retardo do esvaziamento gástrico em camundongos mdx em relação aos valores controles. Os registros das contrações espontâneas obtidos de preparações isoladas de duodeno, íleo, cólon proximal (CP) e cólon distal (CD) mostraram aumento (66%) das amplitudes das contrações maiores no CD do grupo mdx em relação aos valores controles. As curvas concentração-resposta de carbacol (CCh) obtidas nas mesmas preparações, antes e após a incubação de atropina (10-8 M), não mostraram diferenças significativas dos valores do efeito máximo (Emax), ou da concentração efetiva (CE50) do agonista entre os grupos C e mdx. Em todas as preparações, a ativação dos receptores colinoceptivos nicotínicos (nAChRs) pelo agonista dimetilfenilpiperazina (DMPP) produziu relaxamento relacionado às concentrações, mas os valores do relaxamento máximo (Rmax) e CE50 determinados não diferiram entre os grupos C e mdx. Na presença de bloqueio da transmissão dos gânglios entéricos pelo hexametônio (300 μM), o relaxamento produzido pelas menores concentrações do DMPP (3 e 10 μM) foi significativamente reduzido no CP dos grupos C (80 a 59%) e mdx (83 a 51%). Nas mesmas condições, o efeito produzido por todas as concentrações do DMPP (3 a 100 μM) foi reduzido no CD dos grupos C (91 a 93%) e mdx (93 a 36%). O bloqueio da condução nervosa com tetrodotoxina (TTX, 1 μM) reduziu o relaxamento produzido pelas menores concentrações do DMPP no CP e no CD dos dois grupos animais, indicando que o efeito do agonista nicotínico é parcialmente neurogênico. A exposição das preparações de CP e CD do grupo controle ao L-NAME (1 mM), um inibidor da sintase do óxido nítrico (NOS), não afetou o relaxamento produzido por 3 e 10 μM do DMPP, mas potenciou o efeito produzido por 30 e 100 μM do agonista. No grupo mdx, o L-NAME potenciou o relaxamento produzido pela maior concentração do DMPP no CP, sem afetar as demais respostas do agonista no CP e no CD. Além disso, as respostas produzidas pelo DMPP (30 e 100 μM) + L-NAME no CP foram menores no grupo dos mdx em relação aos valores controles. Em conclusão, os resultados obtidos in vivo confirmaram a redução do trânsito intestinal e o retardo do esvaziamento gástrico associados à falta de distrofina e descritos em pacientes com DMD. Essas alterações não foram relacionadas à disfunção da transmissão colinérgica excitatória dos neurônios entéricos. O relaxamento produzido por ativação nicotínica parece envolver a transmissão das vias não colinérgicas inibitórias dos neurônios entéricos mediadas, principalmente, pelo NO. Em conjunto, os resultados apontam para prováveis alterações da transmissão nitrérgica associadas à falta da distrofina e compatíveis com as alterações de motilidade intestinal observadas in vivo e no cólon isolado do modelo mdx. Não foi excluída, porém, a possível participação de outros neurotransmissores não adrenérgicos não colinérgicos nas alterações gastrintestinais observadas no modelo mdx e na DMD.