Investigação de biomarcadores a partir do peptidoma sérico e mapeamento de proteases de pacientes com câncer gástrico
Data
2019-11-28
Autores
Oliveira, Talita Mendes De 
Orientadores
Forones, Nora Manoukian
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Introduction: Gastric cancer (GC) is the fifth most diagnosed malignant neoplasms and the third leading cause of death associated with cancer worldwide. In Brazil, 21.000 new cases were estimated for the biennium 2018-2019. GC is frequently diagnosed at an advanced stage, causing a reduction in therapeutic efficacy rate, and therefore the identification of biomarkers that allows an early diagnosis may result in a better survival. The aims of this study were to perform a comparative analysis of the endogenous peptides (peptidome) of patients diagnosed with gastric adenocarcinoma (GAC) and non-tumor (control) subject, and then mapping the proteases involved in the production of these peptides. Methods: Fifteen GAC serum samples (stage I-IV) and fifteen controls, from which the extracted peptides were pooled of random mode into 5 biological replicates (n = 3) per group and submitted to liquid chromatography coupled to spectrometry mass in tandem (nanoLC-ESI-MS / MS), followed by peptidome-based protease prediction. From the principalcomponents analysis (PCA) based on ions intensity resulting, it was possible to show the correlations between samples pools of each group and the difference between them. Results: A total of 191 peptides were identified corresponding to the cleavage products of 36 proteins involved mainly in the degranulation of platelets and neutrophils, regulation of exocytosis, proteolytic activity and immune response. Further, 29 Serine-, 19 Metallo-, 8 Cysteine-, and 3 Aspartyl-protease was predicted, in which Prothrombin, Plasminogen, MMP14, MMP7, and MMP3 were associated with the highest number of cleavages. From the relative quantification of peptides (label-free quantification), 33 peptides presented significant differences (fold change ≥ 1.5; p-value < 0.05), being 19 increased and 14 reduced in GAC samples. The peptide sequences increased in GAC belong to the Poly-Ig receptor, Cystatin S and Complement C3 proteins, whereas sequences decreased are derived from Prothrombin, Apolipoprotein A-I, Coagulation factor XIII A chain, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4, Alpha-2-HS-glycoprotein, and Transthyretin. In addition, fibrinogens A and B yielded the majority of the peptides, with significant differences in both groups varying by size, of which the longer sequences were reduced in GAC samples, while the smaller ones increased. Using these peptides, 9 proteases had increased predicted activity in GAC samples. Additionally, increasing the phosphopeptide 20ADpSGEGDFLAEGGGVR35 (Fibrinopeptide A) was verified in GAC samples, while their non-phosphorylated counterpart was decreased. Conclusion: The comparison between peptidomes showed the presence of peptides that could be used as potential indicators of tumorigenesis. Increases in proteolytic activity and phosphorylation of fibrinopeptide A may be tumoral biomarkers in serum samples.
Introdução: O câncer gástrico (CG) é a quinta neoplasia maligna mais diagnosticada e a terceira principal causa de morte associada a câncer, mundialmente. No Brasil, foi estimado 21.000 novos casos para o biênio 2018-2019. O CG é frequentemente diagnosticado em estádio avançado ocasionando redução nos índices de eficácia terapêutica e, portanto, a identificação de biomarcadores que possibilitem um diagnóstico pode resultar em uma melhor sobrevida. O objetivo deste estudo foi realizar uma análise comparativa dos peptídeos endógenos (peptidoma) séricos de pacientes diagnósticados com adenocarcinoma gástrico (ACG) e indivíduos sem tumor (controle), tal qual realizar o mapeamento das proteases envolvidas na produção destes peptídeos. Método: Foram utilizadas 15 amostras séricas tumorais (estádio I-IV) e 15 de controles, dos quais os peptídeos extraídos foram, posteriormente, agrupados randomicamente em 5 replicatas biológicas (n = 3) por grupo e submetidas à análise de nano cromatografia acoplada à espectrometria de massas em sequência (nanoLC-ESI-MS/MS), seguido pela predição das proteases baseada no peptidoma. A partir da análise de componente especial (PCA) baseado na intensidade dos íons resultantes, foi possível evidenciar a correlação entre os pools das amostras de cada grupo e diferenciação entre os mesmos. Resultados: Um total de 191 peptídeos foram identificados correspondendo aos produtos de clivagem de 36 proteínas envolvidas principalmente na degranulação de plaquetas e neutrófilos, regulação de exocitose, atividade proteolítica e resposta imune. Foram preditas 29 serino-, 19 metalo-, 8 cisteíno- e 3 aspartil-protease, em que a protombina plasminogênio, MMP14, MMP7 e MMP3 foram associadas ao maior número de clivagens. A partir da quantificação relativa dos peptídeos (método label-free quantification), 33 peptídeos apresentaram diferenças significativas (fold change ≥ 1,5; p-value < 0,05), sendo 19 aumentados e 14 reduzidos em amostras de ACG. As sequências identificadas com aumento relativo em ACG pertencem ao receptor Poli-Ig, Cistatina S e Complemento C3, enquanto as reduzidas são oriundas da Protrombina, Apolipoproteina-AI, Fator de coagulação XIII, Inibidor de cadeia pesada da alfa tripsina, Alfa-2-HS-glicoproteína e Transtirretina. Além destas, os Fibrinogênios A e B originaram a maioria dos peptídeos, tendo diferenças significativas em ambos os grupos variando de acordo com o tamanho. As sequências de maior comprimento foram reduzidas em amostras de ACG e as menores aumentadas. Usando esses peptídeos, 9 proteases tiveram atividades preditas aumentadas em ACG. Adicionalmente, foi verificado o aumento do fosfopeptídeo 20ADpSGEGDFLAEGGGVR35 (Fibrinopeptídeo A) nas amostras de ACG, enquanto a forma não fosforilada foi mensurada de forma reduzida. Conclusões: A comparação entre os peptidomas permitiu constatar a presença de peptídeos que podem ser usados como possíveis indicadores de tumorigênese. Aumentos da atividade proteolítica e fosforilação do fibrinopeptídeo A podem ser marcadores séricos tumorais.
Introdução: O câncer gástrico (CG) é a quinta neoplasia maligna mais diagnosticada e a terceira principal causa de morte associada a câncer, mundialmente. No Brasil, foi estimado 21.000 novos casos para o biênio 2018-2019. O CG é frequentemente diagnosticado em estádio avançado ocasionando redução nos índices de eficácia terapêutica e, portanto, a identificação de biomarcadores que possibilitem um diagnóstico pode resultar em uma melhor sobrevida. O objetivo deste estudo foi realizar uma análise comparativa dos peptídeos endógenos (peptidoma) séricos de pacientes diagnósticados com adenocarcinoma gástrico (ACG) e indivíduos sem tumor (controle), tal qual realizar o mapeamento das proteases envolvidas na produção destes peptídeos. Método: Foram utilizadas 15 amostras séricas tumorais (estádio I-IV) e 15 de controles, dos quais os peptídeos extraídos foram, posteriormente, agrupados randomicamente em 5 replicatas biológicas (n = 3) por grupo e submetidas à análise de nano cromatografia acoplada à espectrometria de massas em sequência (nanoLC-ESI-MS/MS), seguido pela predição das proteases baseada no peptidoma. A partir da análise de componente especial (PCA) baseado na intensidade dos íons resultantes, foi possível evidenciar a correlação entre os pools das amostras de cada grupo e diferenciação entre os mesmos. Resultados: Um total de 191 peptídeos foram identificados correspondendo aos produtos de clivagem de 36 proteínas envolvidas principalmente na degranulação de plaquetas e neutrófilos, regulação de exocitose, atividade proteolítica e resposta imune. Foram preditas 29 serino-, 19 metalo-, 8 cisteíno- e 3 aspartil-protease, em que a protombina plasminogênio, MMP14, MMP7 e MMP3 foram associadas ao maior número de clivagens. A partir da quantificação relativa dos peptídeos (método label-free quantification), 33 peptídeos apresentaram diferenças significativas (fold change ≥ 1,5; p-value < 0,05), sendo 19 aumentados e 14 reduzidos em amostras de ACG. As sequências identificadas com aumento relativo em ACG pertencem ao receptor Poli-Ig, Cistatina S e Complemento C3, enquanto as reduzidas são oriundas da Protrombina, Apolipoproteina-AI, Fator de coagulação XIII, Inibidor de cadeia pesada da alfa tripsina, Alfa-2-HS-glicoproteína e Transtirretina. Além destas, os Fibrinogênios A e B originaram a maioria dos peptídeos, tendo diferenças significativas em ambos os grupos variando de acordo com o tamanho. As sequências de maior comprimento foram reduzidas em amostras de ACG e as menores aumentadas. Usando esses peptídeos, 9 proteases tiveram atividades preditas aumentadas em ACG. Adicionalmente, foi verificado o aumento do fosfopeptídeo 20ADpSGEGDFLAEGGGVR35 (Fibrinopeptídeo A) nas amostras de ACG, enquanto a forma não fosforilada foi mensurada de forma reduzida. Conclusões: A comparação entre os peptidomas permitiu constatar a presença de peptídeos que podem ser usados como possíveis indicadores de tumorigênese. Aumentos da atividade proteolítica e fosforilação do fibrinopeptídeo A podem ser marcadores séricos tumorais.
Descrição
Citação
OLIVEIRA, Talita Mendes de. Investigação de biomarcadores a partir do peptidoma sérico e mapeamento de proteases de pacientes com câncer gástrico. 2019. 61f. Tese (Doutorado em Medicina Translacional) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2019.