Variantes no gene GLA e o perfil enzimático da alfagalactosidase a em pacientes com suspeita de Doença de Fabry
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Date
2019-03-28
Authors
Teixeira, Patricia Varela Lima [UNIFESP]
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Pesquero, Joao Bosco [UNIFESP]
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Tese de doutorado
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Abstract
Objective: To analyze a database with molecular and biochemical results of patients with suspected Fabry disease. From these results, to evaluate the pathogenicity of the variants, as well as to carry out the in vitro characterization of novel mutations, and finally to trace the enzymatic profile of the genotypes in order to evaluate the impact of these variants on the enzyme. Methods: Bioinformatics tools were used to analyze the variants found in the GLA gene of patients with Fabry disease suspected. Patients were divided according to the genotype they carried in order to trace the enzymatic profile and correlation with the pathogenicity. For in vitrocharacterization, experiments were conducted on HeLa cells transfected with wild-type GLA or with mutants plasmids, finally, gene expression as well as the enzymatic activity of α-Gal A were evaluated. Results: 215 men and 48 women presented 103 variants in GLA exons; 57 variants were previously described as pathogenic, eleven described as unknown effect and the other 35 are family-specific mutations. The other patients presented variants in non-coding regions or had no alterations inGLA. In vitro analysis confirmed pathogenicity in mutations classified as pathogenic and possibly pathogenic; in the new mutations classified as with unknown effect, pathogenicity was confirmed in three mutations, the other four did not cause DF. The enzymatic profile revealed a possible non-pathogenicity of variants of unknown effect, as well as variants found in non-coding regions. Finally, the study of haplotypes formed by variants in non-coding regions revealed a high frequency in the control population, similar to that found in patients. Conclusion: The DBS enzymatic activity was markedly reduced in patients with mutations described as pathogenic, as well as in novel variants classified as pathogenic or possibly pathogenic (with in vitro confirmation) when compared with individuals presenting VUS, variants in non-coding regions or without variants, indicating non-pathogenic potential of these latter genotypes.
Objetivo: Analisar um banco de dados com resultado molecular e bioquímico de pacientes com suspeita de doença de Fabry. A partir desses resultados, avaliar a patogenicidade das variantes, bem como, realizar a caracterização in vitro de mutações inéditas, e por fim traçar o perfil enzimático dos diferentes genótipos a fim de avaliar o impacto dessas variantes na enzima. Métodos: Foram usadas ferramentas de bioinformática para analisar as variantes encontradas no gene GLA dos pacientes com suspeita de doença de Fabry. Os pacientes foram divididos de acordo com o genótipo que carregavam a fim de traçar o perfil enzimático e correlação com a patogenicidade. Para a caracterização in vitro, os experimentos foram conduzidos em células HeLa transitoriamente transfectadas com o GLA selvagem ou com os mutantes, por fim, a expressão do gene, bem como a atividade enzimática da α-Gal A foram mensuradas. Resultados: 215 homens e 48 mulheres apresentaram 103 variantes em regiões codificantes do GLA. Cinquenta e sete variantes já estavam previamente descritas como patogênicas na literatura. Dessas, onze foram descritas como variantes de efeito desconhecido (VUS do inglês variants of unknown significance) e as outras 35 são variantes inéditas, encontradas somente em um paciente e sem descrção prévia na literatura. Os outros pacientes apresentaram variantes em regiões não codificantes ou não apresentaram alterações no GLA. Das 35 variantes inéditas, 13 foram caracterizadas in vitro nesse trabalho. A patogenicidade foi confirmada nas variantes classificadas como patogênicas ou potencialmente patogênicas; nas variantes inéditas classificadas como VUS, a patogenicidade foi confirmada em três, as outras quatro não causam DF. O perfil enzimático revelou uma possível não patogenicidade das VUS, bem como das variantes encontradas em regiões não codificantes. Por fim, o estudo dos haplótipos formados por variantes em regiões não codificantes revelou uma frequência alta na população controle, similar a encontrada nos pacientes. Conclusão: A atividade enzimática em DBS foi marcadamente reduzida em pacientes com mutações descritas como patogênicas, bem como em variantes inéditas classificadas como patogênicas ou possivelmente patogênicas (com confirmação in vitro) quando comparados com indivíduos apresentando VUS, variantes em regiões não codificantes ou sem variantes, indicando um potencial não-patogênico destes últimos genótipos.
Objetivo: Analisar um banco de dados com resultado molecular e bioquímico de pacientes com suspeita de doença de Fabry. A partir desses resultados, avaliar a patogenicidade das variantes, bem como, realizar a caracterização in vitro de mutações inéditas, e por fim traçar o perfil enzimático dos diferentes genótipos a fim de avaliar o impacto dessas variantes na enzima. Métodos: Foram usadas ferramentas de bioinformática para analisar as variantes encontradas no gene GLA dos pacientes com suspeita de doença de Fabry. Os pacientes foram divididos de acordo com o genótipo que carregavam a fim de traçar o perfil enzimático e correlação com a patogenicidade. Para a caracterização in vitro, os experimentos foram conduzidos em células HeLa transitoriamente transfectadas com o GLA selvagem ou com os mutantes, por fim, a expressão do gene, bem como a atividade enzimática da α-Gal A foram mensuradas. Resultados: 215 homens e 48 mulheres apresentaram 103 variantes em regiões codificantes do GLA. Cinquenta e sete variantes já estavam previamente descritas como patogênicas na literatura. Dessas, onze foram descritas como variantes de efeito desconhecido (VUS do inglês variants of unknown significance) e as outras 35 são variantes inéditas, encontradas somente em um paciente e sem descrção prévia na literatura. Os outros pacientes apresentaram variantes em regiões não codificantes ou não apresentaram alterações no GLA. Das 35 variantes inéditas, 13 foram caracterizadas in vitro nesse trabalho. A patogenicidade foi confirmada nas variantes classificadas como patogênicas ou potencialmente patogênicas; nas variantes inéditas classificadas como VUS, a patogenicidade foi confirmada em três, as outras quatro não causam DF. O perfil enzimático revelou uma possível não patogenicidade das VUS, bem como das variantes encontradas em regiões não codificantes. Por fim, o estudo dos haplótipos formados por variantes em regiões não codificantes revelou uma frequência alta na população controle, similar a encontrada nos pacientes. Conclusão: A atividade enzimática em DBS foi marcadamente reduzida em pacientes com mutações descritas como patogênicas, bem como em variantes inéditas classificadas como patogênicas ou possivelmente patogênicas (com confirmação in vitro) quando comparados com indivíduos apresentando VUS, variantes em regiões não codificantes ou sem variantes, indicando um potencial não-patogênico destes últimos genótipos.
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Citation
TEIXEIRA, Patricia Varela Lima. Variantes no gene GLA e o perfil enzimático da alfa-galactosidase A em pacientes com suspeita de doença de fabry. 2019. 130f. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2019.