Papel da proteína LAMP-2 associada à membrana lisossomal na invasão celular do Trypanosoma cruzi mediada pela molécula de superfície gp82
Data
2019-10-31
Autores
Rodrigues, Joao Paulo Ferreira 
Orientadores
Yoshida, Nobuko
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Cell invasion by Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigote forms is ediated by the surface glycoprotein gp82, which has the property to bind to the host cell in a receptor-dependent manner and to induce the spreading and exocytosis of lysosomes, events that are necessary for the parasitophorous vacuole formation. The objective of this work was to investigate the involvement of lysosome-associated membrane proteins 1 and 2 (LAMP1 and LAMP2) in the process of cell invasion by metacyclic forms, as well as to determine whether these proteins bind to gp82. By using HeLa cells and T. cruzi strain CL, invasion assays were performed initially in the presence of antibody against LAMP1 or LAMP2. In the presence of anti-LAMP2 antibody, the internalization of metacyclic forms was significantly reduced, whereas the anti-LAMP1 had no effect. HeLa cells deficient in LAMP1 ou LAMP2 were generated and tested for the susceptibility to invasion by metacyclic forms. The levels of invasion by metacyclic forms were significantly lower in LAMP2-deficient cells, as compared to wild type cells, in contrast to LAMP1-deficient cells, which displayed invasion rate similar to that of control cells. Cells deficient in LAMP1 or LAMP2 were used in binding assays of the recombinant protein containing the full gp82 sequence. It was found that the recombinant gp82 binding to LAMP2-deficient cells was significantly reduced, as compared to LAMP1-deficient and wild type cells. The possibility that LAMP2 could be the receptor for gp82 was examined in coimmunoprecipitation assays, in which extracts of HeLa cells and parasites were incubated with magnetic beads coupled to anti-LAMP1 or anti-LAMP2 antibody. Binding of gp82 to LAMP2, but not to LAMP1, was detected. In co-immunoprecipitation assay, in which beads coupled to the anti-gp82 monoclonal antibody were used, gp82
A invasão celular pelas formas tripomastigotas metacíclicas do Trypanosoma cruzi é mediada pela glicoproteína de superfície gp82, que possui a propriedade de aderir à célula hospedeira de maneira receptor-dependente e induzir o espalhamento e exocitose de lisossomos, eventos necessários para a formação do vacúolo parasitóforo. O objetivo deste trabalho foi investigar o envolvimento das proteínas LAMP1 e LAMP2 (Lysosome-associated membrane proteins 1 and 2) no processo de invasão celular pelas formas metacíclicas, assim como determinar se essas proteínas se ligam à gp82. Utilizando células HeLa e a cepa CL de T. cruzi, foram realizados, inicialmente, ensaios de invasão na presença de anticorpo contra LAMP1 ou LAMP2. Na presença do anticorpo anti-LAMP2 a internalização das formas metacíclicas foi significativamente reduzida, enquanto o anticorpo anti-LAMP1 não teve efeito. Células HeLa deficientes em LAMP1 ou LAMP2 foram geradas e testadas quanto à suscetibilidade à invasão pelas formas metacíclicas. Os níveis de invasão das formas metacíclicas foram significativamente menores em células deficientes em LAMP2, em comparação às células selvagens, ao contrário das células deficientes em LAMP1, que apresentaram taxa de infecção similar à das células controle. As células deficientes em LAMP1 ou LAMP2 foram utilizadas em ensaios de ligação da proteína recombinante contendo a sequência completa da gp82. Foi observada ligação da gp82 recombinante às células LAMP2-deficientes significativamente reduzida em relação às células LAMP1-deficientes e às células selvagens.A possibilidade de LAMP2 ser o receptor para gp82 foi examinada em ensaios de co-imunoprecipitação, em que extratos de células HeLa e dos parasitas foram incubados com beads magnéticos acoplados ao anticorpo anti-LAMP1 ou anti-LAMP2. Foi detectada a ligação de gp82 a LAMP2, mas não a LAMP1. No ensaio de co-imunoprecipitação em que beads acoplados ao anticorpo monoclonal anti-gp82 foram utilizados, foi também detectada a ligação de gp82 a LAMP2.Nossos dados indicam que a invasão celular por formas metacíclicas ocorre pela ligação da gp82 ao seu receptor LAMP2.
A invasão celular pelas formas tripomastigotas metacíclicas do Trypanosoma cruzi é mediada pela glicoproteína de superfície gp82, que possui a propriedade de aderir à célula hospedeira de maneira receptor-dependente e induzir o espalhamento e exocitose de lisossomos, eventos necessários para a formação do vacúolo parasitóforo. O objetivo deste trabalho foi investigar o envolvimento das proteínas LAMP1 e LAMP2 (Lysosome-associated membrane proteins 1 and 2) no processo de invasão celular pelas formas metacíclicas, assim como determinar se essas proteínas se ligam à gp82. Utilizando células HeLa e a cepa CL de T. cruzi, foram realizados, inicialmente, ensaios de invasão na presença de anticorpo contra LAMP1 ou LAMP2. Na presença do anticorpo anti-LAMP2 a internalização das formas metacíclicas foi significativamente reduzida, enquanto o anticorpo anti-LAMP1 não teve efeito. Células HeLa deficientes em LAMP1 ou LAMP2 foram geradas e testadas quanto à suscetibilidade à invasão pelas formas metacíclicas. Os níveis de invasão das formas metacíclicas foram significativamente menores em células deficientes em LAMP2, em comparação às células selvagens, ao contrário das células deficientes em LAMP1, que apresentaram taxa de infecção similar à das células controle. As células deficientes em LAMP1 ou LAMP2 foram utilizadas em ensaios de ligação da proteína recombinante contendo a sequência completa da gp82. Foi observada ligação da gp82 recombinante às células LAMP2-deficientes significativamente reduzida em relação às células LAMP1-deficientes e às células selvagens.A possibilidade de LAMP2 ser o receptor para gp82 foi examinada em ensaios de co-imunoprecipitação, em que extratos de células HeLa e dos parasitas foram incubados com beads magnéticos acoplados ao anticorpo anti-LAMP1 ou anti-LAMP2. Foi detectada a ligação de gp82 a LAMP2, mas não a LAMP1. No ensaio de co-imunoprecipitação em que beads acoplados ao anticorpo monoclonal anti-gp82 foram utilizados, foi também detectada a ligação de gp82 a LAMP2.Nossos dados indicam que a invasão celular por formas metacíclicas ocorre pela ligação da gp82 ao seu receptor LAMP2.