PPG - Microbiologia e Imunologia
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- ItemAcesso aberto (Open Access)Avaliação do papel do óxido nítrico endógeno no crescimento do fungo Paracoccidioides brasiliensis(Universidade Federal de São Paulo, 2024-04-21) Castro, Beatriz Furue de [UNIFESP]; Batista, Wagner Luiz [UNIFESP]; Batista, Patricia Xander [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3620553457348403; http://lattes.cnpq.br/4373797404389169; http://lattes.cnpq.br/9753268295410593Fungos do gênero Paracoccidioides são responsáveis pela paracoccidioidomicose (PCM), uma infecção fúngica sistêmica prevalente na América Latina, especialmente no Brasil. No ambiente, eles assumem uma forma de crescimento conhecida como micélio, típica dos fungos. Porém, ao serem inalados por mamíferos hospedeiros, esses fungos se transformam em sua forma patogênica, chamada levedura, aproveitando a temperatura corporal (37°C). Essa alternância entre micélio e levedura é crucial para o desenvolvimento da PCM. Seu desenvolvimento depende de fatores do hospedeiro, bem como das estratégias de adaptação do fungo, conhecidas como fatores de virulência. Estes incluem o termodimorfismo, produção de adesinas, proteases e mecanismos de detoxificação contra as espécies reativas geradas pelo sistema imunológico do hospedeiro. O óxido nítrico (NO) desempenha um papel ambíguo e essencial na relação parasita-hospedeiro. Ele atua como parte do ambiente hostil gerado pelo sistema imunológico do hospedeiro, mas também é produzido endogenamente pelos fungos, com funções fisiológicas relacionadas à proliferação celular, desenvolvimento, patogenicidade e virulência. Portanto, este estudo investigou o papel da produção endógena de NO em P. brasiliensis. Para tanto, nós utilizamos um inibidor farmacológico L-NAME (um inibidor seletivo da óxido nítrico sintase) e c-PTIO (sequestrador de NO). Os mecanismos de produção de NO em fungos ainda não foram totalmente esclarecidos, mas duas vias metabólicas são destacadas na literatura: a via dependente de arginina e a via dependente de nitrato. Embora os fungos do gênero Paracoccidiodes não apresentem genes ortólogos às NOS em seu genoma, eles possuem genes relacionados às nitrito e nitrato redutases. A ausência de genes semelhantes às NOS não implica que não haja proteínas com funções semelhantes no fungo, como evidenciado neste estudo, após exposição das células de P. brasiliensis ao L-NAME, pela redução significativa do NO endógeno, inibição do crescimento celular e da transição termodimórfica para a forma patogênica, além da modulações nos principais componentes da parede cellular (β-glucanas, quitina e mananas). Adicionalmente, foi obsevado aumento da expressão gênica do gene CSP37, relacionado à capacidade de adesão do patógeno, e interferência no crescimento celular. O c-PTIO, utilizado como sequestrador de NO, também demonstrou a importância do NO endógeno para o fungo, interferindo no crescimento celular, modulação dos componentes da parede celular e aumento da expressão gênica do gene arginase. Isso reforça a presença de mais de uma via de produção de NO no fungo. Em resumo, este estudo destaca a relevância da produção endógena de NO para a proliferação celular e modulação dos componentes da parede celular do fungo, e possivelmente na patogenicidade e virulência de P. brasiliensis.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Análise da diversidade genética em agentes da aspergilose usando marcadores AFLP (Amplified fragment length polymorphism) e microssatélites(Universidade Federal de São Paulo, 2024-04-29) Lopez, Úrsula dos Santos [UNIFESP]; Rodrigues, Anderson Messias [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4150370898980718; http://lattes.cnpq.br/6676178525777239Os fungos saprófitos do gênero Aspergillus são amplamente encontrados no ambiente. Embora a inalação diária de esporos seja natural e inofensiva para indivíduos saudáveis, pacientes com fatores de risco, como neutropenia e imunossupressão, têm maior propensão à aspergilose invasiva pulmonar (IPA). Além desses fatores clássicos, novos riscos, como infecções respiratórias prévias, COVID-19 e condições críticas em UTIs, estão emergindo. Há uma lista de espécies patogênicas em Aspergillus, como A. flavus, A. terreus, A. niger e A. nidulans, que estão em ascensão. Contudo, A. fumigatus destaca-se como o fungo mais comumente isolado em infecções humanas. A compreensão dos dados epidemiológicos locais e a exploração da diversidade interespecífica e intraespecífica são cruciais para orientar abordagens clínicas, dada a falta de um teste único para diagnóstico. Nesse contexto, a tipagem molecular destaca-se como um método essencial para aprimorar o controle de infecções. Assim, este trabalho foi desenvolvido com o propósito de avaliar a técnica de AFLP (do inglês Amplified Fragment Length Polymorphism) como uma ferramenta epidemiológica de tipagem molecular. O objetivo é explorar a diversidade genética e a estrutura populacional dos agentes da aspergilose humana, comparando essa técnica com outros métodos, como sequenciamento e microssatélites. Para otimizar custos e tempo, aplicou-se a técnica AFLP in silico para prever os fragmentos gerados, permitindo a escolha de combinações nucleotídicas mais eficientes na diferenciação dos isolados por espécie. Seis combinações destacaram-se nos estudos in silico, sendo padronizadas in vitro, e três foram selecionadas para prosseguir no estudo com 87 isolados de Aspergillus de diferentes regiões geográficas. De maneira geral, a pesquisa introduziu três marcadores inéditos que se revelaram eficazes na distinção entre os isolados de Aspergillus por seção, além de evidenciarem exploração das estruturas genéticas, tanto em níveis mais abrangentes quanto em níveis mais detalhados. Adicionalmente, comparou-se os resultados obtidos pelo AFLP com os marcadores microssatélites, utilizando um conjunto de nove marcadores STRAf. A forte correlação entre os resultados dos dois ensaios confirma a consistência e confiabilidade das abordagens utilizadas. Importante ressaltar que, apesar de o AFLP e o STRAf apresentarem características distintas e vantagens específicas, ambos demonstraram ser excelentes para a avaliação das relações entre as cepas de Aspergillus.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Análise genomica comparativa de Trypanosoma dionisii com linhagens de Trypanosoma cruzi restritas a morcegos e de uma cepa virulenta de T. cruzi (clone CL Brener)(Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-12) Pereira, Werica Bernardo [UNIFESP]; Silveira Filho, José Franco da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8810765839775059; http://lattes.cnpq.br/7014192766092756Tripanossomas de morcegos têm sido objeto de estudos sobre a história evolutiva do Trypanosoma cruzi. Foi proposto que T. cruzi e Trypanosoma rangeli evoluíram de uma linhagem de tripanossomas de morcegos adaptados a mamíferos terrestres (hipótese de semeadura de morcegos). Utilizando diferentes abordagens genômicas, comparamos o genoma de Trypanosoma dionisii (Tdio) com aqueles de cepas de T. cruzi restritas a morcegos (Trypanosoma cruzi marinkellei - Tcmar; T. cruzi Bat -TcBat) e uma cepa virulenta de T. cruzi (CL Brener , CLB). Por todas as métricas utilizadas, o Tdio possui um tamanho de genoma menor que o T. cruzi CLB, Tcmar TcBat e Tcmar. Os genes parálogos e membros de famílias multigênicas estão em menor número no genoma do Tdio. Além disso, seu cariótipo é composto por cromossomos de menor tamanho. A análise de genes ortólogos no genoma completo identificou clusters compartilhados entre os isolados estudados (Tdio, T. cruzi CLB, Tcmar e TcBat) e clusters compartilhados apenas por tripanossomas de morcegos. Também identificamos clusters específicos para cada isolado, os quais estão enriquecidos em famílias multigênicas e proteínas hipotéticas que representam novas variantes geradas por recombinação e mutação. A análise genômica sugere que Tcmar e TcBat sejam parentes próximos da linhagem TcI de T. cruzi e ainda estão em curso de especiação. Nossas análises também mostraram que Tdio é o primeiro tripanosoma do clado T. cruzi que alberga duas classes de retroposons, o elemento L1Tc característico dos tripanossomas do clado T. cruzi, e também o retroposon Tbingi descrito no clado T. brucei. L1Tc e Tbingi são retroposons autônomos longos do clado Ingi. A presença de Tbingi e L1Tc em Tdio também foi descrita em Trypanosoma congolense. A presença de Tbingi em Tdio poderia ser explicada pela transferência horizontal durante a evolução dessas espécies ou que a linhagem ancestral abrigava ambos os retroelementos antes da especiação dos tripanossomas africanos e americanos. Para investigar a sintenia entre os genomas de Tdio e T. cruzi, os scaffolds de Tdio foram alinhados com os cromossomos de T. cruzi. Vários ascaffold de Tdio correspondem a 40-60% do tamanho dos cromossomos do T. cruzi com identidade de 75-85%. Há uma notável conservação da ordem dos genes, embora possam ocorrer rearranjos, deleções e duplicações. Entre os blocos sintênicos T. cruzi-CLB e TcBat, a identidade variou de 90-98% com conservação da ordem genética. A análise de aCGH identificou elevada proporção de eventos de perdas de DNA em isolados de morcegos Trypanosoma (Tdio, Tcmar e TcBat) em relação ao genoma de referência (T. cruzi CLB). O elevado número de alterações de perdas de DNA nesses isolados pode ser devido à expansão do genoma em T. cruzi, principalmente nas linhagens híbridas como CLB. O conteúdo gênico das alterações de perda foi associado a famílias multigênicas, em concordância com a redução dessas famílias no genoma dos tripanossomas de morcegos. Observamos que as alterações de perda são flanqueadas por membros de famílias multigênicas, sugerindo que esses genes desempenham um papel importante nos eventos de recombinação. Por outro lado, genes hipotéticos de proteínas estão associados a regiões de ganho. Alterações de perda também foram identificadas em grandes extensões dos cromossomos, sugerindo a presença de aneuploidia segmentar e cromossômica em Tcmar, TcBat e Tdio. A maioria dos scaffolds de Tdio foram mapeados em um único cromossomo homólogo em T. cruzi CLB. No entanto, vários scaffolds foram mapeados em 2 cromossomos diferentes de CLB, sugerindo que alguns cromossomos Tdio seriam híbridos, compostos de segmentos de diferentes cromossomos de T. cruzi. Os dados de aCGH e sequenciamento genomico indicam a ausência em Tdio de um compartimento genômico disruptivo, o qual é enriquecido em famílias multigênicas envolvidas no escape do parasita do sistema imunológico e na invasão da célula hospedeira. Vários genes envolvidos na invasão celular por tripomastigotas de T. cruzi, glicoproteínas de superfície não foram detectados em Tdio. Os resultados sugerem que a estrutura do genoma do Tdio é muito semelhante à do T. cruzi em termos de conteúdo gênico e colinearidade, mas com diferenças no número de cópias e na distribuição das famílias multigênicas.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Papel do complexo Ikaros-HDAC na regulação da expressão de micro-RNAs apoptóticos por linfócitos B-1(Universidade Federal de São Paulo, 2023-11-01) Costa, Lucas Vasconcelos Soares [UNIFESP]; Popi, Ana Flavia [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6073701470193039; http://lattes.cnpq.br/5604107493098752Os linfócitos B-1, um subtipo de células B, podem expressar o marcador CD5 e são responsáveis pela produção de IgM natural. Além disso, são capazes de autorrenovação e reconhecimento de autoantígenos, o que poderia facilitar sua diferenciação em células hiperproliferativas. De fato, estas células estão envolvidas no desenvolvimento da leucemia linfocítica crônica (LLC), caracterizada pelo aumento de células B-1 com expressão de CD5 e IgM, além de BCR responsivo a autoantígenos. A principal característica da LLC é a intensa atividade proliferativa de linfócitos B-1 CD5+CD23+ na medula óssea e órgãos linfoides e consequente acúmulo de células resistentes à morte no sangue periférico. Dentre as moléculas envolvidas na patogênese, os fatores de transcrição da família Ikaros (Ikzf1) encontram-se alterados. A principal forma de atividade de Ikaros se dá pela associação a complexos, que envolvem a presença de histonas deacetilases (HDAC) em especial a HDAC1 e HDAC2. No contexto da LLC, foi descrito que as HDACs se encontram, em sua maioria, super expressas e isto influencia na expressão de micro-RNAs (miRNAs) envolvidos na regulação da apoptose intrínseca. Assim, a proposta deste trabalho é investigar o papel de Ikaros na expressão de microRNAs e moléculas envolvidas na via de apoptose, a fim de fazer uma correlação com a LLC. As células B-1 murinas foram obtidas do peritônio de camundongos C57Bl/6 após o enriquecimento por cell sorting. Primeiramente foi confirmada a co-localização e interação de Ikaros e HDAC1 em células B-1 por imunofluorescência e co-imunoprecipitação respectivamente. A seguir, a expressão de Ikaros foi silenciada nestas células por siRNA e neste cenário, além de uma maior viabilidade celular, foi observado um aumento significativo na síntese de HDAC1 e c-Myc. Em nível proteico, observamos que a perda de Ikaros regula negativamente quase todas as proteínas apoptóticas analisadas. No estudo mais específico das moléculas da via, houve o aumento na expressão de Bcl-2 e da forma clivada da caspase-3, condizentes com o aumento da viabilidade. O array de miRNAs revelou a mudança na expressão de 37 miRNAS, dentre eles a baixa expressão dos miRNAs -29c e -145. O tratamento com um inibidor de HDACs, além de diminuir a viabilidade celular independente de Ikaros, restaurou os níveis do miR-29c na ausência de Ikaros mas não do miR-145. A super expressão do miR-29c foi capaz de reduzir os níveis de Bcl-2 e aumentar a expressão de Bax, enquanto a super expressão de miR-145, além de reduzir os níveis de c-Myc, aumentou a expressão do miR-29c e diminuiu Bcl-2 e MCL-1. No ensaio funcional, o miR-29c foi capaz de reverter os efeitos da ausência de Ikaros, mas a restauração do miR-145 e a combinação de ambos os miRNAs pareceu levar estas células à morte, além de modular a razão Bcl-2/Bax. Em um segundo modelo de estudo, investigamos a ausência de Ikaros em células B-1 no ambiente medular. Neste modelo, foi observado aumento significativo na viabilidade das células silenciadas sob co-cultura com linhagem células do estroma medular (OP9). Ainda, houve a mudança na expressão de 42 miRNAS, mas a baixa expressão dos miRNAs -29c e -145 se manteve. Os efeitos da inibição das HDACs e da restauração dos miRNAs se manteve como no modelo anterior mesmo com os estímulos fornecidos pelas células estromais. Assim, estes dados confirmam a participação de Ikaros na regulação de moléculas envolvidas na sobrevivência das células B-1, e os mecanismos incluem HDACs e o fator de transcrição c-Myc. Além disso, estes dados indicam que a baixa expressão dos miRNAs -145 e -29c, devido à desregulação de Ikaros, poderia ser uma das vias moleculares para induzir resistência à apoptose em células B leucêmicas. Por fim, foi postulado o miR-145 como um possível alvo terapêutico para a LLC.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Efeito da exposição à radiação ionizante no ciclo celular, morfologia e crescimento do Trypanosoma cruzi(Universidade Federal de São Paulo, 2024-01-29) Marchiano, Fernanda Sycko [UNIFESP]; Silveira Filho, José Franco da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8810765839775059; http://lattes.cnpq.br/6932738720326743A radiação ionizante induz quebras na dupla fita de DNA e rearranjos cromossômicos em T. cruzi. Para investigar os efeitos da radiação na organização dogenoma de T. cruzi, epimastigotas de CL Brener foram expostos a doses de 100 e 500Gy de radiação gama e analisados quanto ao crescimento em cultura e recuperação do cariótipo. Entre 18 clones isolados por diluição seriada, epimastigotas do clone F9 isolado de uma população exposta à radiação de 500 Gy, apresentou notáveis alterações no crescimento, motilidade e alterações morfológicas no flagelo em meio de cultura axenico. Por coloração de Giemsa e ensaios de imunofluorescência com anticorpos específicos contra proteínas da estrutura flagelar observamos alterações no padrão de fluorescência e morfologia do flagelo que está parcialmente descolado do corpo celular. Análise por microscopia eletrônica corroborou os dados acima e revelou que o cinetoplasto está disposto lateralmente ao núcleo. Para entender o déficit decrescimento do clone F9, estimamos a duração das fases do ciclo celular em epimastigotas em proliferação sincronizados com a hidroxiureia e verificamos que a duração da fase G1 foi significativamente reduzida no mutante. Por meio de ensaios de invasão de células de mamíferos com tripomastigotase multiplicação intracelular foi possível observar redução significativa na invasão pelo clone F9, apesar do parasita ser ainda capaz de perpetuar a infecção. Para compreender as alterações observadas ao nível genômico, utilizamos a técnica de aCGH (“array Comparative Genomic Hybridization”) onde observamos uma série de alterações de ganho e em menor número de perda de DNA. Diversos genes envolvidos em processos biológicos como estrutura flagelar e motilidade, “splicing”, transcrição, tradução, reparo de DNA e ciclo celular foram alterados, sendo a maioria das alterações relacionadas ao ganho de DNA. Estes resultados sugerem que o aumento no número de cópias dos genes por amplificação genica (aneuploidia segmentar ou cromossômica) foi a solução encontrada pelo parasita para compensar os efeitos da radiação. Nas famílias multigênicas envolvidas na invasão de células de mamíferos (MASP, TcMUC, Trans-Sialidase, DGF-1, GP63 e SAP), as perdas foram predominantes e podem ter afetado a capaciade invasiva de tripomastigotas. T. cruzi demonstra ter eficiente mecanismo de reparo, capaz de reparar a degradação cromossômica observada nos parasitas irradiados com dosagens de até 500 Gy. Além de reparo eficiente, o parasita se demonstra ser resiliente às alterações morfológicas em uma organela multifuncional em patógenos, como o flagelo.