PPG - Microbiologia e Imunologia
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- ItemEmbargoExplorando a diversidade genética da enolase de Paracoccidioides (Onygenales)(Universidade Federal de São Paulo, 2024-10-16) Paixão, Danilo Francisco da [UNIFESP]; Rodrigues, Anderson Messias [UNIFESP]; Camargo, Zoilo Pires [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0632912481397728; http://lattes.cnpq.br/4150370898980718; http://lattes.cnpq.br/6586467308356494A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose prevalente na América Latina e um grave problema de saúde pública no Brasil. Causada por fungos do gênero Paracoccidioides, que inclui sete espécies, como P. brasiliensis s. str., P. americana, P. restrepiensis, P. venezuelensis, P. lutzii, P. loboi e P. cetii. Nas últimas décadas, novas espécies foram identificadas, técnicas moleculares para diagnóstico e estudos sobre virulência e resposta imune foram aprimorados. Apesar dos progressos, desafios persistem como o diagnóstico tardio, opções terapêuticas limitadas e forte impacto socioeconômico, especialmente em áreas rurais. Portanto, pesquisas sobre a PCM são essenciais para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico, tratamento e prevenção, buscando reduzir a mortalidade e morbidade. Este estudo focou na diversidade genética da enzima enolase em espécies de Paracoccidioides, avançando o conhecimento sobre sua taxonomia, filogenia e imunogenicidade. O gene da enolase em Paracoccidioides possui 1624–1628 pares de bases, com 5 éxons e 4 íntrons, codificando uma proteína de 438 aminoácidos. A análise de 88 sequências, revelou alta conservação, com 1579 sítios conservados e 52 variáveis, dos quais 44 foram considerados informativos para inferências filogenéticas. As análises filogenéticas (NJ, ML e MP) resultaram em topologias semelhantes onde P. lutzii assume uma posição mais basal em relação ao complexo P. brasiliensis, levando a formação de grupos distintos e concordância com a classificação taxonômica das espécies. A análise de haplótipos identificou 18 distintos, sendo o haplótipo 13 o mais frequente em S1a. A diversidade haplotípica (Hd = 0,8757) indicou boa variabilidade genética, com baixa taxa de fluxo gênico entre populações e eventos de desequilíbrio de ligação no gene (ZnS = 0,4172, P < 0,05). Testes de neutralidade não mostraram desvios significativos (Fs = 6,193), e a diversidade nucleotídica indicou purificação seletiva. O teste MK revelou sinais de seleção positiva em algumas comparações (e.g., P. lutzii vs. P. restrepiensis e P. lutzii vs. P. brasiliensis S1a). A análise da diversidade nucleotídica revelou que a diversidade nucleotídica em sítios sinônimos (πs = 0,02407) foi consideravelmente maior do que em sítios não sinônimos (πa = 0,00141). Observou-se que a maioria dos 15 epítopos de células B da enolase preditos in silico são altamente conservados, indicando seu potencial como alvos para o desenvolvimento de métodos diagnósticos e vacinas para a paracoccidioidomicose. As análises de epidemiologia molecular (MST, PCA, MDS e SOM) confirmaram a estruturação populacional. A conservação evolutiva da enolase evidenciou regiões funcionais, como o sítio ativo e os locais de ligação de cofatores. A análise LERI revelou duas comunidades de resíduos coevoluídos, sugerindo interações funcionais na região C-terminal. A predição de epítopos identificou alvos conservados para o desenvolvimento de vacinas e diagnósticos. Os resultados obtidos neste estudo contribuem significativamente para o entendimento da diversidade genética e evolução de Paracoccidioides spp. e fornecem informações valiosas sobre o gene da enolase, com potencial aplicação no desenvolvimento futuro de ferramentas diagnósticas e vacinas para a PCM.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Estudo da diversidade e dinâmica evolutiva populacional de vírus de RNA emergentes e reemergentes(Universidade Federal de São Paulo, 2024-11-29) Nunes, Danilo Rosa [UNIFESP]; Janini, Luiz Mário Ramos [UNIFESP]; Braconi, Carla Torres [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6342740138292278; http://lattes.cnpq.br/5713863164263481; http://lattes.cnpq.br/6317613339444750No século XXI, a emergência e reemergência de doenças infecciosas tem constituído um desafio significativo e crescente para a saúde pública global. A pandemia de COVID-19 e epidemias virais recentes destacaram que a maioria dos agentes patogênicos humanos tem origem zoonótica, em sua maior parte vírus de RNA. Diversas doenças virais emergiram no século XXI, incluindo a Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2). Além deste coronavírus, os arbovírus, vírus vetorados por artrópodes, desempenham um papel crucial nas emergências de saúde pública global, embora negligenciados. Neste contexto, este estudo, teve como objetivo principal caracterizar os padrões evolutivos e mapear mutações sobre pressão de seleção em três modelos virais emergentes que apresentam genoma de RNA fita simples de senso positivo: o Coronavírus SARS-CoV-2, e dois Alphavirus: (ii) o vírus Chikungunya e (iii) o vírus Mayaro. Primeiramente, para o SARS-CoV-2 foram utilizadas aproximadamente 200.000 sequências de Coronavírus humanos e SARS-CoV-2 obtidas de bancos de dados públicos, as quais foram curadas filtradas e agrupadas por região, países e variantes. Nossos resultados demonstraram mutações além de sinais de recombinação, nas variantes de preocupação (VOC) e nas variantes de interesse (VOI) do Brasil, Índia, China, EUA e países da América do Sul. Além disso, foi possível detectar mutações compartilhadas na proteína Spike do SARS-CoV-2 nas diferentes variantes, correlacionando essas mutações com a propagação viral em diferentes países. Os resultados evidenciaram que o SARS-CoV-2 estava sob forte pressão de seleção direcional em um processo de evolução convergente. Por outro lado, as adaptações evolutivas dos Alphavirus CHIKV e MAYV foram caracterizadas através da análise de aproximadamente 637 sequências de genoma completo desses Alphavirus, CHIKV e MAYV, utilizando o software Hyphy para análise de pressão de seleção e BEAST v1.10.4 a fim de caracterizar a dinâmica populacional. Os resultados evidenciaram que os Alphavirus, CHIKV e MAYV, estavam sujeitos a diferentes pressões evolutivas, majoritariamente pressão de seleção purificadora. No entanto, estes resultados permitem sugerir que as diferenças biogeográficas podem ser atribuídas parcialmente às mutações sob pressão de seleção diversificadora, bem como as características de organização genômicas, distintas em ambos os vírus. Enfim, a dinâmica evolutiva do coronavírus SARS-CoV-2 e dos Alphavirus, vírus Chikungunya e vírus Mayaro foi demonstrada e sugere que diferentes padrões de seleção estão agindo sobre os genomas destes vírus. Ademais, nossos resultados contribuíram para elucidar os processos evolutivos, com as possíveis implicações para o desenvolvimento de políticas públicas destes vírus de genoma de RNA polaridade positiva.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Comunicação celular in vitro mediada por vesículas extracelulares isoladas de fungos patogênicos cultivados em condições de estresse(Universidade Federal de São Paulo, 2024-11-18) Silva, Camila Pereira da [UNIFESP]; Puccia, Rosana [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8787784443554068Vesículas extracelulares (EVs) são estruturas arredondadas delimitadas por uma membrana lipídica de camada dupla. Elas transportam moléculas de natureza diversa e de forma protegida para o meio extracelular, com potencial de estabelecer comunicação à distância. Dados prévios do laboratório mostraram a capacidade de EVs do patógeno fúngico Paracoccicioides brasiliensis modular o fenótipo de células do mesmo isolado e apontaram para uma ampla alteração no proteoma e transcriptoma de EVs de P. brasiliensis (isolado vPb18, virulento) e Candida albicans (cepa 90028) cultivados em condições de estresse oxidativo e nitrosativo subletal. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de EVs produzidas nessas condições no fenótipo de outras células fúngicas. Os experimentos de dose-resposta mostraram que concentrações de 5 mM de NaNO2 e 0,5 mM de H2O2 são subletais, porém causam estresse em células de vPb18 cultivadas na presença de estressor por 24 h, a 36oC, em meio sólido de Ham’s F-12 acrescido de 1,5% de glicose (Ham/glc). Para C. albicans, a concentração de 5 mM de H2O2 é subletal e causa estresse nas mesmas condições de cultura, como sugerido pela incorporação do reagente di-hidroetílico. As vEVs produzidas por vPb18 cultivado em condições subletais de estresse nitrosativo (vEVNO) e oxidativo (vEVOxi) não apresentaram diferença estatisticamente significante, em relação aos respectivos controles vEVcNO e vEVcOxi, no diâmetro médio estimado por rastreamento de nanopartículas (NTA), na variação do potencial Zeta, ou no conteúdo de proteína. O diâmetro hidrodinâmico avaliado por dispersão dinâmica de luz (DLS) não variou para vEVNO, mas foi estatisticamente superior para vEVOxi, assim como o índice de polidispersão, porém o conteúdo de esterol foi estatisticamente inferior ao do controle. As EVCaOxi, produzidas por C. albicans cultivada sob estresse oxidativo subletal, apresentaram valores estatisticamente semelhantes aos do controle EVcCa no diâmetro aferido por NTA, na variação do potencial Zeta e no índice de polidispersão. O valor médio de DLS e o conteúdo de proteína foram estatisticamente superiores para EVCaOxi em relação ao controle EVcCa. O efeito de EVs foi testado por co-incubação por 4 h, a 36oC, de vEVNO, vEVOxi e seus controles com células de P. brasiliensis aPb18 (variante atenuada) e Pb3, com subsequente cultivo em spots de diluição seriada em meio Ham/glc, acrescido de agentes estressores. Em nossas condições experimentais, observamos uma visível redução da resistência de aPb18 ao Congo red e ao NaCl após pré-incubação com vEVOxi. Outros efeitos foram discretos e independentes da origem das vEVs, a saber: a) aumento da resistência de aPb18 ao sorbitol após pré-incubação com vEVNO,vEVOxi e seus controles; b) sutil aumento da resistência do isolado Pb3 ao NaCl, mediado por vEVNO, seu controle e ao Congo red, mediado por vEVOxi e seu controle. A co-incubação de EVCaOxi e seu controle com células de C. albicans resultou em um discreto aumento de resistência ao Calcofluor white, porém não ao Congo red ou ao H2O2, nas condições testadas. Entretanto, EVCaOxi causou uma sutil diminuição de crescimento das leveduras mesmo na ausência de estressor. Em conjunto, os resultados deste trabalho sugerem que as EVs produzidas sob estresse oxidativo subletal sofrem uma variação na constituição da superfície tanto para P. brasiliensis como para C. albicans, resultando em aumento no diâmetro hidrodinâmico. Todavia, a carga superficial de potencial Zeta, que foi negativa sugerindo estabilidade das partículas, aparentemente não foi afetada. Por outro lado, a redução de resistência de aPb18 ao Congo red e ao NaCl, mediada por vEVOxi, assim como a redução da viabilidade de C. albicans, mediada por EVCaOxi, deve estar relacionada a alterações nas vEVs causadas pelo estresse oxidativo. Os resultados desta dissertação são originais e serão explorados mais amplamente no laboratório no futuro próximo.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Papel da acetilação na regulação de processos biológicos: uma abordagem de bioinformática e biologia sintética(Universidade Federal de São Paulo, 2024-07-01) Bonifácio, Bruno Souza [UNIFESP]; Moretti, Nilmar Silvio [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/2131472726202687; http://lattes.cnpq.br/6655678336873160A acetilação de lisina é uma modificação pós-traducional crucial e avanços em técnicas proteômicas permitiram investigar os acetilomas de diferentes espécies, destacando a importância da acetilação em diversos organismos. Para melhor entender o papel dessa modificação na regulação de processos celulares, na primeira parte desse trabalho, avaliamos uma gama de 50 acetilomas publicados entre 2009 e 2022 de espécies de vários grupos filogenéticos: bactérias, fungos, protozoários, vermes, plantas, insetos, peixes e mamíferos. Análises dos níveis de acetilação, mostraram que bactérias apresentam o maior número de sítios de acetilação, seguidas por fungos e protozoários. Proteínas com um único sítio de acetilação foram predominantes em todas as espécies. Além disso, analisamos domínios acetilados em todas as espécies, constatando que proteínas contendo os domínios HSP70 foram as que apresentaram maiores níveis de acetilação. Os processos metabólicos de ATP e as vias de aminoacil-tRNA sintetase mostraram-se altamente acetilados, destacando seus papéis cruciais na produção de energia e na expressão gênica, respectivamente. Nossa análise também revelou acetilação significativa em vias metabólicas relacionadas à glicose e à produção de ATP. Além disso, verificamos que o mecanismo regulatório da acetilação na proteína superóxido dismutase A (SODA) parece ser conservado entre diferentes espécies. Na segunda parte do trabalho, exploramos o sistema de biologia sintética do par ortogonal da pirrolisil-tRNA sintetase e do tRNApyl (Pylt) para o estudo da acetilação proteica de resíduos específicos de lisina. Portanto, um dos objetivos foi implementar esse método para expressar proteínas contendo resíduos de lisina acetilada usando como modelo as enzimas aldolase de T. brucei e SODA de T. cruzi. Conseguimos expressar e purificar ambas as enzimas e validar a presença da acetilação por Western blot e dot-blot. Utilizando as proteínas acetiladas purificadas confirmamos o efeito inibitório da acetilação, como observado anteriormente pelo nosso grupo. Com isso, conseguimos estabelecer a ferramenta de par-ortogonal para expressão de proteínas acetiladas, abrindo novas oportunidades para estudar modificações proteicas em tripanosomatídeos e outras espécies.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Trafs (TNF receptor associated factors) de Schistosoma mansoni: caracterização molecular e filogenética para o entendimento de seus papéis no desenvolvimento parasitário e no parasitismo(Universidade Federal de São Paulo, 2024) Bertevello, Claudio Romero [UNIFESP]; Santos, Katia Cristina Oliveira Pereira [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4758763489087525; http://lattes.cnpq.br/2025091249869612Objetivo: Caracterização in silico e análise filogenética dos genes homólogos dos TRAFs de S. mansoni e de outros helmintos utilizando os dados públicos de genoma e transcriptoma. Métodos: O contexto genômico e as marcas de H3K4me3 das TRAFs de S. mansoni foram analisados por um genome browser. Os níveis de expressão dos transcritos de SmTRAF1 e SmTRAF2 foram obtidos em publicações e bancos que continham dados de expressão nos estágios de desenvolvimento, em infecções unissexual e bissexual e expressão espacial de sequenciamento single-cell de vermes adultos. Buscas por homólogos de TRAF nos outros helmintos foram realizadas por BLAST e por HMMER nos genomas depositados no Wormbase Parasite. A análise dos domínios conservados e regiões “coiled-coil” foram feitas utilizando os programas SMART, CDD e MarCoil, respectivamente. O alinhamento global dos domínios MATH para a filogenia foi realizado por MUSCLE, e a análise filogenética foi computada por Inferência Bayesiana utilizando sequências referências dos TRAFs de mamíferos, aves e invertebrados. Resultados: Marcas de H3K4me3 para TRAF1 (Smp_336340) revelaram picos em miracídio (isoforma 1), adulto e cercaria (isoformas 2 e 3), indicando que o início da predição gênica está correto. A isoforma 1 de SmTRAF1 apresentou expressão em cercaria, e menor expressão em esquistossômulos. A isoforma 2 é mais expressa em miracídios e cercaria, e a isoforma 3 foi expressa em miracídio e machos. SmTRAF1 é mais expresso em machos e fêmeas de infecção unissexual (imaturos), com o mesmo padrão nas gônadas destes parasitas. A expressão espacial de SmTRAF1 é detectada na maioria dos tipos celulares, com destaque em células progenitoras de neoblastos, neoblastos e neurônios. O TRAF 2, que não é encontrado na montagem atual do genoma, possui expressão somente em cercaria. A busca por homólogos de TRAF em outros helmintos resultou na identificação de 45 genes preditos em 31 espécies de platelmintos e 70 genes preditos em 57 espécies de nematoides (79,49% e 43,85% das espécies depositadas no Wormbase parasite, respectivamente). As análises filogenéticas dos domínios MATH indicaram que os TRAFs dos helmintos (inclusive TRAF1 de S. mansoni) se agruparam majoritariamente com os TRAF4 das sequências referências. A exceção foi SmTRAF2 se agrupou junto às sequencias referências de TRAF2 e alguns homólogos de M. lignano e S. mediterranea (platelmintos de vida livre) se agruparam no mesmo ramo que TRAF3. Conclusões: As isoformas de SmTRAF1 (agora denominada SmTRAF4) se expressam diferencialmente ao longo dos estágios de desenvolvimento e do status de maturação sexual e SmTRAF2 é expresso exclusivamente em cercarias, indicando envolvimento em processos biológicos e vias de sinalização distintos. A maioria das espécies de platelmintos depositadas no Wormbase Parasite possuem homólogos de TRAF, opostamente ao observado em nematoides. Estes homólogos são essencialmente ortólogos de TRAF4, o TRAF evolutivamente mais ancestral que classicamente interage com receptores de NGF.