Nova estratégia para descoberta de anti-helmínticos utilizando o organismo modelo Caenorhabditis elegans
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Data
2019-03-28
Autores
Cintra, Giovana Aparecida De Souza [UNIFESP]
Orientadores
Freitas Junior, Lucio Holanda Gondim De [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
Diseases caused by soil-transmitted helminths are among the most common infections in the world, affecting marginalized, low-income and resource-poor populations. It is estimated that more than one billion people, especially in developing countries in Africa, Asia and America, are infected with one or more species of helminths. The emergence of resistance to the main anthelmintics used highlights the need for the introduction of new therapeutic agents. The free-living nematode Caenorhabditis elegans is widely recognized as a model organism for investigating the biology of parasitic nematodes due to its easy laboratory culture, short generation time and fully sequenced genome. Most commercial anthelmintics are active against C. elegans, levamisole and benzimidazole derivatives, and this animal model has been useful in understanding the mechanism of action of the same, making it a useful system for selection and investigation of compounds with potential anthelmintic activity. The methodologies currently used to identify new compounds are based on the subjective evaluation of the motile worms, or involve transgenic organisms. In this way there is a need for the establishment of a more objective, sensitive and reproducible biological assay. In the present study the development and standardization of a new methodology of in vivo high content screening using the C. elegans is described. The assay is based on viability assessment by differential incorporation of two fluorescent molecular markers, DB-1, derived from the 2,1,3- benzothiadiazole core and propidium iodide. This model stands out from the previous tests for using an automated imaging platform and later analysis of the images by commercial software, thus quantitatively evaluating the viability in an objective way. In addition, it allows the use of animals without genetic modifications. The establishment of a robust and reproducible assay allowed the screening of 2280 compounds, which are part of three libraries: (i) the commercial LOPAC library, from which three compounds with a potency up to 400x greater than levamisole hydrochloride were selected; (ii) the library of compounds / extracts from different collaborators, with new therapeutic and chemical classes; (iii) the Pathogen Box library, from which three previously reported compounds with activity against malaria, schistosomiasis and tuberculosis were identified. The candidates identified in this work are starting point for studies of medicinal chemistry, aiming to improve their potency and effectiveness. It is also worth noting that two of the compounds selected in the collaborator screening reduced the parasitemia in the in vivo model of Ascarissum infection by 61.96% and 59.78%, confirming the translational value of the C. elegans biological model. In conclusion, the assay developed in this work was successfully established and provides a solid contribution to the initial phases of the discovery of new anthelminthic drugs.
As doenças causadas por helmintos transmitidos pelo solo estão entre as infecções mais comuns no mundo, afetando majoritariamente populações marginalizadas, de baixa renda e com poucos recursos. Estima-se que mais de um bilhão de pessoas, principalmente em países em desenvolvimento da África, Ásia e América, estão infectadas com uma ou mais espécies de helmintos. A seleção de linhagens resistentes aos principais anti-helmínticos utilizados destaca a necessidade da introdução de novos agentes terapêuticos. O nematoide de vida livre Caenorhabditis elegans é amplamente reconhecido como um organismo modelo para a investigação da biologia de nematoides parasitas devido ao seu fácil cultivo em laboratório, tempo de geração curto e gen oma completamente sequenciado. A maioria dos antihelmínticos comercializados é ativo contra C. elegans, por exemplo os derivados do levamisol e benzimidazol, e este modelo animal tem sido útil no entendimento do mecanismo de ação dos mesmos, tornando-o um útil sistema para seleção e investigação de compostos com potencial atividade anti-helmíntica. As metodologias atualmente usadas para identificar novos compostos baseiam-se na avaliação subjetiva da motilidade dos vermes, ou envolve organismos transgênicos. Dessa maneira, existe a necessidade do estabelecimento de um ensaio biológico mais objetivo, sensível e reprodutível. No presente estudo é descrito o desenvolvimento e padronização de uma nova metodologia de triagem in vivo de alto conteúdo com base no modelo de C. elegans. O ensaio baseia-se na avaliação da viabilidade por meio da incorporação diferencial de dois marcadores moleculares fluorescentes, o DB-1, derivado do núcleo 2,1,3-benzotiadiazol e o iodeto de propídeo. Esse modelo destaca-se dos ensaios anteriores por utilizar uma plataforma de imageamento automatizada e posterior análise das imagens por um software comercial, assim avaliando quantitativamente a viabilidade de forma objetiva. Além disso, possibilita o uso de animais sem modificações genéticas. O estabelecimento de um ensaio robusto e reprodutível permitiu a triagem de 2280 compostos, os quais fazem parte de três bibliotecas: (i) a biblioteca comercial LOPAC, da qual foram selecionados três compostos com potencia até 400x maior que o cloridrato de levamisol; (ii) a biblioteca de compostos/extratos de diferentes colaboradores, com classes terapêuticas e químicas inéditas; (iii) a biblioteca Pathogen Box, da qual foram identificados três compostos previamente descritos com atividade contra malária, esquistossomose e tuberculose. Os candidatos identificados nesse trabalho são ponto de partida para estudos de química medicinal, visando melhorar a potencia e eficácia das mesmas. Destaca-se ainda, que dois dos compostos selecionados na triagem de colaboradores reduziram a carga parasitária no modelo in vivo de infecção com Ascaris sum em cerca de 60%, confirmando o valor translacional do modelo biológico C. elegans. Em suma, conclui-se que o ensaio desenvolvido nesse trabalho foi estabelecido com sucesso, e traz uma sólida contribuição para as fases iniciais da descoberta de novos fármacos para helmintíases.
As doenças causadas por helmintos transmitidos pelo solo estão entre as infecções mais comuns no mundo, afetando majoritariamente populações marginalizadas, de baixa renda e com poucos recursos. Estima-se que mais de um bilhão de pessoas, principalmente em países em desenvolvimento da África, Ásia e América, estão infectadas com uma ou mais espécies de helmintos. A seleção de linhagens resistentes aos principais anti-helmínticos utilizados destaca a necessidade da introdução de novos agentes terapêuticos. O nematoide de vida livre Caenorhabditis elegans é amplamente reconhecido como um organismo modelo para a investigação da biologia de nematoides parasitas devido ao seu fácil cultivo em laboratório, tempo de geração curto e gen oma completamente sequenciado. A maioria dos antihelmínticos comercializados é ativo contra C. elegans, por exemplo os derivados do levamisol e benzimidazol, e este modelo animal tem sido útil no entendimento do mecanismo de ação dos mesmos, tornando-o um útil sistema para seleção e investigação de compostos com potencial atividade anti-helmíntica. As metodologias atualmente usadas para identificar novos compostos baseiam-se na avaliação subjetiva da motilidade dos vermes, ou envolve organismos transgênicos. Dessa maneira, existe a necessidade do estabelecimento de um ensaio biológico mais objetivo, sensível e reprodutível. No presente estudo é descrito o desenvolvimento e padronização de uma nova metodologia de triagem in vivo de alto conteúdo com base no modelo de C. elegans. O ensaio baseia-se na avaliação da viabilidade por meio da incorporação diferencial de dois marcadores moleculares fluorescentes, o DB-1, derivado do núcleo 2,1,3-benzotiadiazol e o iodeto de propídeo. Esse modelo destaca-se dos ensaios anteriores por utilizar uma plataforma de imageamento automatizada e posterior análise das imagens por um software comercial, assim avaliando quantitativamente a viabilidade de forma objetiva. Além disso, possibilita o uso de animais sem modificações genéticas. O estabelecimento de um ensaio robusto e reprodutível permitiu a triagem de 2280 compostos, os quais fazem parte de três bibliotecas: (i) a biblioteca comercial LOPAC, da qual foram selecionados três compostos com potencia até 400x maior que o cloridrato de levamisol; (ii) a biblioteca de compostos/extratos de diferentes colaboradores, com classes terapêuticas e químicas inéditas; (iii) a biblioteca Pathogen Box, da qual foram identificados três compostos previamente descritos com atividade contra malária, esquistossomose e tuberculose. Os candidatos identificados nesse trabalho são ponto de partida para estudos de química medicinal, visando melhorar a potencia e eficácia das mesmas. Destaca-se ainda, que dois dos compostos selecionados na triagem de colaboradores reduziram a carga parasitária no modelo in vivo de infecção com Ascaris sum em cerca de 60%, confirmando o valor translacional do modelo biológico C. elegans. Em suma, conclui-se que o ensaio desenvolvido nesse trabalho foi estabelecido com sucesso, e traz uma sólida contribuição para as fases iniciais da descoberta de novos fármacos para helmintíases.