Avaliação de resistência aos antifúngicos e virulência em isolados de Candida tropicalis provenientes de infecções de corrente sanguínea
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Data
2019-12-18
Autores
Favarello, Larissa Molina [UNIFESP]
Orientadores
Melo, Analy Salles De Azevedo [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Objective: To evaluate isolates of Candida tropicalis from bloodstream infections from Brazilian medical centers included in surveillance studies (2007-2018) to evaluate susceptibility to azoles and to characterize potential virulence in vivo model with the nematode Caenorhabditis elegans. Material and Methods: Clinical isolates stored in the LEMI Microorganism Bank previously identified by phenotypic methods such as Candida tropicalis were selected. The isolates were thawed and seeded on Sabouraud dextrose agar and CHROMagar® Candida media for reactivation and purity evaluation; Species were confirmed by the Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass (MALDI-TOF MS, Bruker®) method using 25% formic acid in a protein extraction protocol; In vitro susceptibility was performed with the antifungals: amphotericin B, fluconazole, voriconazole and anidulafungin using the broth microdilution method recommended by the Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI), document M27ED4. Concomitantly, the prevalence of trailing with low-high phenotype was observed for azole antifungals; virulence was evaluated using the survival curve in C. elegans specimens infected with C. tropicalis, C. albicans, C. auris reference strains and clinical isolates of C. tropicalis according to azole resistance profiles. Results: 200 sequential isolates were recovered from hospitalized patients with positive blood cultures, which were previously identified by phenotypic methods as C. tropicalis over the period of 2007 to 2018. The sequencing of 21 clinical isolates (10.5%) and the reference strain C. tropicalis ATCC 750 was performed to improve the in-house protein database. The other 179 C. tropicalis isolates (89.5%) were properly identified using the in-house database (MALDI-TOF MS). Regarding the susceptibility profile, all isolates were susceptible to amphotericin B, one isolate was resistant to anidulafungin. It was found that 3.5% of the isolates were non-susceptible to azoles. To facilitate the analysis, we divided the isolates into two periods: P1 (2007-2012) and P2 (2013-2018). In P1 (2007-2012) the resistance rate was 1.9% for fluconazole and 0% for voriconazole, being found for P2 (2013-2018) resistance rate of 3.2% for fluconazole and 1% for voriconazole, no statistical difference was observed (p = 0.42). The virulence assay with C. elegans was observed on the second day after infection, the survival rate for C. auris was 90%; 50% for C. albicans; and 0%\20% for the clinical isolate (1534/17) and reference strains (ATCC 750) of C. tropicalis respectively. Conclusions: (i) It was possible to accurately identify by the MALDI-TOF MS method the isolates of C. tropicalis, after enriching the in house database; (ii) Five isolates of C. tropicalis with resistance profile to azole antifungals were found; (iii) Comparing the periods P1 and P2, there was an increase tendency in the rate of azoles resistance, but there was no statistical difference; (iv) One anidulafungin resistant C. tropicalis isolate was found; (v) Survival curves with C. elegans suggested that C. tropicalis, regardless of susceptibility profile, was more virulent than C. auris (P <0.05).
Objetivo: Avaliar isolados de Candida tropicalis provenientes de infecção de corrente sanguínea, oriundas de centros médicos brasileiros incluídos em estudos de vigilância (2007-2018), quanto ao perfil de suscetibilidade a azólicos e caracterizar o potencial de virulência em modelo “in vivo” com o nematódeo Caenorhabditis elegans. Material e Métodos: Foram selecionados isolados clínicos armazenados no Banco de Micro-organismos do LEMI previamente identificados por métodos fenotípicos como Candida tropicalis. Os isolados foram descongelados e semeados nos meios ágar Sabouraud dextrose e em CHROMagar® Candida, para reativação e avaliação da pureza; A confirmação de espécie foi realizada através do método Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass (MALDI-TOF MS, Bruker®)utilizando protocolo de extração proteica com ácido fórmico a 25%; A suscetibilidade in vitro foi realizada com os antifúngicos: anfotericina B, fluconazol, voriconazol e anidulafungina através do método de microdiluição em caldo preconizado pelo Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) utilizando o documento M27ED4. Concomitantemente, foi observada a prevalência de trailing com fenótipo low-high para os antifúngicos azólicos; A virulência foi avaliada utilizando a curva de sobrevida em exemplares de C. elegans infectados com cepas referência de C. tropicalis, C. albicans, C. auris e isolados clínicos de C. tropicalis de acordo com perfis de resistência aos azólicos. Resultados: Foram recuperados 200 isolados sequenciais de pacientes hospitalizados com hemoculturas positivas, os quais foram previamente identificados por métodos fenotípicos como C. tropicalis ao longo do período de 2007 a 2018; Foi realizado o sequenciamento de 21 isolados clínicos (10,5%) e da cepa referência C. tropicalis ATCC 750 para ampliação do banco proteico in-house; Os outros 179 isolados de C. tropicalis (89,5%) foram devidamente identificados utilizando o banco in house (MALDI-TOF MS); Quanto ao perfil de suscetibilidade, todos os isolados foram suscetíveis a anfotericina B, um isolado foi resistente a anidulafungina e foi constatado que 3,5% dos isolados presentes neste estudo eram não-suscetíveis aos azólicos; Para facilitar a análise, dividimos os isolados em dois períodos: P1 (2007-2012) e P2 (2013-2018). Em P1 (2007-2012) a taxa de resistência foi de 1,9% para fluconazol e 0% para voriconazol, sendo encontrado para P2 (2013-2018) taxa de resistência de 3,2% para fluconazol e 1% para voriconazol, não sendo observada diferença estatística (p=0.42); No ensaio de virulência em C. elegans, observou-se no segundo dia após a infecção que a sobrevida foi de 90% para C. auris, 50% para C. albicans, para C. tropicalis observou-se 20% de sobrevida com a cepa referência e 0% com o isolado clínico resistente (1534/17). Conclusões: (i) Foi possível identificar com acurácia pelo método proteico MALDI-TOF MS os isolados de C. tropicalis, depois de enriquecer o banco in-house; (ii) Foram encontrados 5 isolados de C. tropicalis com perfil de resistência aos antifúngicos azólicos; (iii) Comparando os períodos P1 e P2, observou-se tendência de aumento da taxa de resistência aos azólicos, porém não houve diferença estatística; (iv) Foi encontrado um isolado de C. tropicalis resistente a anidulafungina; (v) As curvas de sobrevida com C. elegans sugeriram que C. tropicalis, independente do perfil de suscetibilidade, foi mais virulenta que C. auris (P < 0.05).
Objetivo: Avaliar isolados de Candida tropicalis provenientes de infecção de corrente sanguínea, oriundas de centros médicos brasileiros incluídos em estudos de vigilância (2007-2018), quanto ao perfil de suscetibilidade a azólicos e caracterizar o potencial de virulência em modelo “in vivo” com o nematódeo Caenorhabditis elegans. Material e Métodos: Foram selecionados isolados clínicos armazenados no Banco de Micro-organismos do LEMI previamente identificados por métodos fenotípicos como Candida tropicalis. Os isolados foram descongelados e semeados nos meios ágar Sabouraud dextrose e em CHROMagar® Candida, para reativação e avaliação da pureza; A confirmação de espécie foi realizada através do método Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass (MALDI-TOF MS, Bruker®)utilizando protocolo de extração proteica com ácido fórmico a 25%; A suscetibilidade in vitro foi realizada com os antifúngicos: anfotericina B, fluconazol, voriconazol e anidulafungina através do método de microdiluição em caldo preconizado pelo Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) utilizando o documento M27ED4. Concomitantemente, foi observada a prevalência de trailing com fenótipo low-high para os antifúngicos azólicos; A virulência foi avaliada utilizando a curva de sobrevida em exemplares de C. elegans infectados com cepas referência de C. tropicalis, C. albicans, C. auris e isolados clínicos de C. tropicalis de acordo com perfis de resistência aos azólicos. Resultados: Foram recuperados 200 isolados sequenciais de pacientes hospitalizados com hemoculturas positivas, os quais foram previamente identificados por métodos fenotípicos como C. tropicalis ao longo do período de 2007 a 2018; Foi realizado o sequenciamento de 21 isolados clínicos (10,5%) e da cepa referência C. tropicalis ATCC 750 para ampliação do banco proteico in-house; Os outros 179 isolados de C. tropicalis (89,5%) foram devidamente identificados utilizando o banco in house (MALDI-TOF MS); Quanto ao perfil de suscetibilidade, todos os isolados foram suscetíveis a anfotericina B, um isolado foi resistente a anidulafungina e foi constatado que 3,5% dos isolados presentes neste estudo eram não-suscetíveis aos azólicos; Para facilitar a análise, dividimos os isolados em dois períodos: P1 (2007-2012) e P2 (2013-2018). Em P1 (2007-2012) a taxa de resistência foi de 1,9% para fluconazol e 0% para voriconazol, sendo encontrado para P2 (2013-2018) taxa de resistência de 3,2% para fluconazol e 1% para voriconazol, não sendo observada diferença estatística (p=0.42); No ensaio de virulência em C. elegans, observou-se no segundo dia após a infecção que a sobrevida foi de 90% para C. auris, 50% para C. albicans, para C. tropicalis observou-se 20% de sobrevida com a cepa referência e 0% com o isolado clínico resistente (1534/17). Conclusões: (i) Foi possível identificar com acurácia pelo método proteico MALDI-TOF MS os isolados de C. tropicalis, depois de enriquecer o banco in-house; (ii) Foram encontrados 5 isolados de C. tropicalis com perfil de resistência aos antifúngicos azólicos; (iii) Comparando os períodos P1 e P2, observou-se tendência de aumento da taxa de resistência aos azólicos, porém não houve diferença estatística; (iv) Foi encontrado um isolado de C. tropicalis resistente a anidulafungina; (v) As curvas de sobrevida com C. elegans sugeriram que C. tropicalis, independente do perfil de suscetibilidade, foi mais virulenta que C. auris (P < 0.05).