Análise do genoma e do potencial de virulência de uma cepa de Escherichia coli uropatogênica portadora de marcadores de e. Coli diarreiogênica
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Data
2019-08-29
Autores
Valiatti, Tiago Barcelos [UNIFESP]
Orientadores
Amaral, Tania Aparecida Tardelli Gomes Do [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Urinary tract infection is one of the most prevalent in the world, with uropathogenic Escherichia coli (UPEC) being its main agent. Although E. coli strains can receive genes encoding virulence factors by horizontal transfer, little is known about the occurrence of virulence genes of diarrheagenic E. coli (DEC) in UPEC strains. In a previous study, our laboratory identified an UPEC strain (UPEC 252)that carrieed the eae gene, which encodes an adhesive protein (Intimin), is located in the pathogenicity island termed LEE (locus of enterocyte effacement) and is a diagnostic marker of two DEC pathotypes: enteropathogenic E. coli (EPEC) and enterohemorrhagic E. coli (EHEC). The presence of the LEE region indicates the ability of the bacteria to cause attaching-effacing (A/E) lesions in enterocytes. This project aimed to analyze the genome and the pathogenic potential of the UPEC 252 strain. To that end, its total genome was sequenced, and phenotypic virulence and antimicrobial resistance assays were conducted. To evaluate the role of intimin in its pathogenicity, an UPEC 252 mutant strain in the eae gene was constructed and evaluated. The in vitro analysis of the UPEC 252 genome for the presence of 118 virulence genes of the different E. coli strains revealed the occurrence of ompA, mat, fimA, traT, cvpA, focA, fhuA, fhuE, tonB, fepA, astA, celB, iss, air, malX, clb, astA, ecpA, hcpA and csgAB. The presence of all the genes that make up the LEE region and seven genes collectively known as non-LEE (cif, nleF, nleH, nleE, nleB, nleG and espJ) were also identified. The functionality of the LEE region was confirmed by immunoblotting for the Intimin and EspB proteins. In addition, assays performed to identify the ability to polymerize actin filaments (FAS) revealed the ability of UPEC 252 to promote A/E lesion in HeLa cells. UPEC 252 presented a heterogeneous adherence pattern, with bacteria adhered randomly, occasionally forming loose microcolonies in HeLa cells. Phenotypic tests showed that UPEC 252 is resistant to the bactericidal power of human serum, does not produce biofilm and is sensitive to all antimicrobials tested. The eae mutant strain constructed (UPEC 252 Δeae) was compared to the wild-type strain in adherence assays in HeLa, T24, HEK 293T, Caco-2 and LS 174T cells. In these assays, it was demonstrated that in the absence of intimin there was a partial decrease of adherence in HeLa, T24 and HEK 293T cells, whereas in intestinal lineages (Caco-2 and LS 174T), there was a strong reduction in the adherence capacity of UPEC 252, suggesting that Intimin is the major adhesin used by UPEC 252 to adhere to these cell lines in vitro. In addition, the invasion tests performed with the UPEC 252 wt and UPEC 252 Δeae strains in the HeLa, HEK 293T and Caco-2 cell lines showed a low percentage of internalized bacteria. The findings observed in this study suggest that UPEC 252 is potentially more virulent, because it presents a hybrid genome, sharing functional virulence genes characteristic of ExPEC and DEC, which would allow it to cause disease in the intestinal and extraintestinal sites.
A infecção do trato urinário é uma das mais prevalentes em todo o mundo, sendo a Escherichia coli uropatogênica (UPEC) seu principal agente. Embora cepas de E. coli possam receber genes que codificam fatores de virulência por transferência horizontal, pouco se conhece sobre a ocorrência de genes de virulência de patotipos de E. coli diarreiogênica (DEC) em cepas de UPEC. Em estudo anterior, nosso laboratório identificou uma cepa de UPEC (UPEC 252), que era portadora do gene eae. Esse gene codifica uma proteína adesiva (intimina), está localizado na ilha de patogenicidade LEE (locus of enterocyte effacement) e consiste em um marcador de diagnóstico de dois patotipos de DEC: E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli enterohemorrágica (EHEC). A presença da região LEE indica a capacidade da bactéria causar lesão attaching-effacing (A/E) em enterócitos. Este projeto visou analisar o genoma e o potencial patogênico da cepa UPEC 252. Para tanto, seu genoma total foi sequenciado e foram conduzidos ensaios fenotípicos de virulência e resistência a antimicrobianos. Para avaliar o papel de intimina na sua patogenicidade, foi construída e avaliada uma cepa UPEC 252 mutante no gene eae. A análise in silico do genoma dessa cepa quanto à presença de 118 genes de virulência dos diferentes patotipos de E. coli revelou a ocorrência de ompA, fimA, traT, cvpA, focA, fhuA, fhuE, tonB, fepA, astA, celB, iss, air, malX, clb, astA, ecpA, hcpA e csgAB. Observou-se ainda a presença de todos os genes que compõe a região LEE e sete genes denominados não-LEE (cif, nleF, nleH, nleE, nleB, nleG e espJ). A funcionalidade da região LEE foi confirmada por immunoblotting para as proteínas intimina e EspB e na pesquisa da capacidade de polimerizar filamentos de actina (Fluorescence actin staining-FAS) em células HeLa. A UPEC 252 apresentou padrão de aderência heterogêneo, com bactérias aderidas aleatoriamente, formando eventuais microcolônias frouxas em células HeLa. Testes fenotípicos demonstraram que a UPEC 252 é resistente ao poder bactericida do soro humano, não produz biofilme e é sensível a todos os antimicrobianos testados. O mutante no gene eae (UPEC 252 Δeae) foi comparado com a cepa selvagem em ensaios de aderência em células HeLa, T24, HEK 293T, Caco-2 e LS 174T. Nesses ensaios, verificou-se que, na ausência de intimina, ocorre uma diminuição parcial da aderência em células HeLa, T24 e HEK 293T, enquanto nas linhagens intestinais (Caco-2 e LS 174T), houve forte redução na aderência da UPEC 252Δeae, sugerindo que intimina é a principal adesina da UPEC 252 nessas linhagens Ainda, os testes de invasão realizados com as cepas UPEC 252 wt e UPEC 252 Δeae nas linhagens HeLa, HEK 293T e Caco-2, revelaram um baixo percentual de bactérias intracelulares. Os achados deste estudo sugerem que a UPEC 252 é potencialmente mais virulenta por apresentar um genoma híbrido, compartilhando genes de virulência funcionais, característicos de ExPEC e DEC, o que lhe permitiria causar doença nos sítios intestinal e extraintestinal.
A infecção do trato urinário é uma das mais prevalentes em todo o mundo, sendo a Escherichia coli uropatogênica (UPEC) seu principal agente. Embora cepas de E. coli possam receber genes que codificam fatores de virulência por transferência horizontal, pouco se conhece sobre a ocorrência de genes de virulência de patotipos de E. coli diarreiogênica (DEC) em cepas de UPEC. Em estudo anterior, nosso laboratório identificou uma cepa de UPEC (UPEC 252), que era portadora do gene eae. Esse gene codifica uma proteína adesiva (intimina), está localizado na ilha de patogenicidade LEE (locus of enterocyte effacement) e consiste em um marcador de diagnóstico de dois patotipos de DEC: E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli enterohemorrágica (EHEC). A presença da região LEE indica a capacidade da bactéria causar lesão attaching-effacing (A/E) em enterócitos. Este projeto visou analisar o genoma e o potencial patogênico da cepa UPEC 252. Para tanto, seu genoma total foi sequenciado e foram conduzidos ensaios fenotípicos de virulência e resistência a antimicrobianos. Para avaliar o papel de intimina na sua patogenicidade, foi construída e avaliada uma cepa UPEC 252 mutante no gene eae. A análise in silico do genoma dessa cepa quanto à presença de 118 genes de virulência dos diferentes patotipos de E. coli revelou a ocorrência de ompA, fimA, traT, cvpA, focA, fhuA, fhuE, tonB, fepA, astA, celB, iss, air, malX, clb, astA, ecpA, hcpA e csgAB. Observou-se ainda a presença de todos os genes que compõe a região LEE e sete genes denominados não-LEE (cif, nleF, nleH, nleE, nleB, nleG e espJ). A funcionalidade da região LEE foi confirmada por immunoblotting para as proteínas intimina e EspB e na pesquisa da capacidade de polimerizar filamentos de actina (Fluorescence actin staining-FAS) em células HeLa. A UPEC 252 apresentou padrão de aderência heterogêneo, com bactérias aderidas aleatoriamente, formando eventuais microcolônias frouxas em células HeLa. Testes fenotípicos demonstraram que a UPEC 252 é resistente ao poder bactericida do soro humano, não produz biofilme e é sensível a todos os antimicrobianos testados. O mutante no gene eae (UPEC 252 Δeae) foi comparado com a cepa selvagem em ensaios de aderência em células HeLa, T24, HEK 293T, Caco-2 e LS 174T. Nesses ensaios, verificou-se que, na ausência de intimina, ocorre uma diminuição parcial da aderência em células HeLa, T24 e HEK 293T, enquanto nas linhagens intestinais (Caco-2 e LS 174T), houve forte redução na aderência da UPEC 252Δeae, sugerindo que intimina é a principal adesina da UPEC 252 nessas linhagens Ainda, os testes de invasão realizados com as cepas UPEC 252 wt e UPEC 252 Δeae nas linhagens HeLa, HEK 293T e Caco-2, revelaram um baixo percentual de bactérias intracelulares. Os achados deste estudo sugerem que a UPEC 252 é potencialmente mais virulenta por apresentar um genoma híbrido, compartilhando genes de virulência funcionais, característicos de ExPEC e DEC, o que lhe permitiria causar doença nos sítios intestinal e extraintestinal.
Descrição
Citação
VALIATTI, Tiago Barcelos. Análise do genoma e do potencial de virulência de uma cepa de Escherichia coli uropatogênica portadora de marcadores de E. coli diarreiogênica. 2019. 83f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia e Imunologia) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2019.