Avaliação da heme oxigenase 1 no pré-condicionamento nefrotóxico in vivo e in vitro

Abstract

Nephrotoxicity is one of the major side effects of aminoglycoside antibiotics such as Gentamicin (Genta). Preconditioning (PC) refers to the situation in which an organ or tissue subjected to an aggression acquires resistance or responds less intensely when a new aggression is repeated. The mechanism of CP is well studied, it is believed that mechanisms such as increased activity of antioxidant enzymes such as Hemeoxygenase 1 (HO1) may be involved. Objective: To study the participation of Heme oxygenase 1 (HO1) and the nephroprotective effect of PC induced by Genta in vivo and in vitro. Methods In vivo: Wistar rats were divided into Control (CTL), Genta treated animals for 10 consecutive days (IU), animals treated with Genta and Hemin for 10 consecutive days (IU + HEMIN), animals preconditioned with Genta ID) and animals preconditioned with Genta and treated concomitantly with Hemin (ID + HEMIN). Blood and urine samples were collected before and after treatment (groups IU and IU + HEMIN) and postCP (ID and ID + HEMIN groups) for analysis of creatinine, urea, sodium excretion fraction, urinary peroxides, lipid peroxidation, protein carbonylated, plasma antioxidant fraction, enzymatic activity (SOD and CAT). Animals were sacrificed and kidneys removed for immunohistochemistry for SOD and CAT. Methods In vitro: Human proximal tubule (HK2) cells were subdivided into control (CTL) groups, treated with Genta for 24h (IU), cells treated with Genta and the HO1 inducer for 24hs (IU + HEMIN). cells treated with Genta and the HO1 inhibitor for 24h concomitantly (IU + ZNPP), cells preconditioned with Genta and exposed to the antibiotic after 9 days (ID), Insulto double associated with the inducer of HO1 (ID + HEMIN ) and double insult associated with the HO1 inhibitor (ID + ZNPP). Necrosis and apoptosis were evaluated, respectively, by the Acridine Orange / Etho Bromide and Hoescht 33342 dyes. The expression of HO1 was performed by Western Blot. Results: Rats treated with Genta for 10 consecutive days (UI) presented an increase in plasma creatinine, urea, proteinuria, and sodium excretion fraction, characterizing the Nephrotoxic AKI model. The PC (ID) protected the animals from increasing these parameters. We observed increased urinary, lipid peroxides and carbonylated protein in the UI group in relation to the CTL and PC (ID) group. Conversely we observed an increase in the antioxidant fraction of the plasma, as well as an increase in the immunostaining for antioxidant enzymes (superoxide dismutase1 and catalase) in the PC group in relation to the other groups. Interestingly, the HO1 (Hemin) inducer potentiated these effects. In the main target of Genta, the proximal tubular cell, PC inhibited cell death by antibioticinduced necrosis and apoptosis, and Hemin potentiated the protective effect of CP on viability. Conclusion: PC protected the animals from GENT induced by GENT and this effect was mediated by the inhibition of oxidative stress, by direct action in the proximal tubular cell and induction of antioxidant enzymes, such as HO1, which may be a potential alternative in treatment nephrotoxic ARF by aminoglycosides.

A nefrotoxicidade é um dos principais efeitos colaterais dos antibióticos aminoglicosídeos como a Gentamicina (Genta). O précondicionamento (PC) referese à situação em que um órgão ou tecido submetido a uma agressão adquire resistência ou responde menos intensamente quando uma nova agressão é repetida. O mecanismo do PC é bem estudado, acreditase que mecanismos como o aumento da atividade de enzimas antioxidantes como a Hemeoxigenase 1 (HO1) podem estar envolvidos. Objetivo: Estudar a participação da Heme oxigenase 1 (HO1) e o efeito nefroprotetor do PC induzido pela Genta in vivo e in vitro. Métodos in vivo: Ratos Wistar foram divididos nos grupos Controle (CTL), animais tratados com Genta por 10 dias consecutivos (IU), animais tratados com Genta e Hemin por 10 dias consecutivos (IU+HEMIN), animais précondicionados com Genta (ID) e animais précondicionados com Genta e tratados concomitantemente com Hemin (ID+HEMIN). Amostras de sangue e urina foram coletadas pré, pós Tratamento (grupos IU e IU+HEMIN) e pós PC (grupos ID e ID+HEMIN) para análise de creatinina, uréia, fração de excreção de sódio, peróxidos urinários, peroxidação lipídica, proteína carbonilada, Fração antioxidante do plasma, Atividade enzimática (SOD e CAT). Os animais foram eutanaziados e os rins retirados para imunohistoquímica para SOD e CAT. Métodos in vitro: Células de túbulo proximal humana (HK2) foram subdivididas nos grupos controle (CTL), tratadas com Genta por 24h (IU), células tratadas com Genta e com o indutor da HO1 por 24hs (IU+HEMIN), células tratadas com Genta e com o inibidor da HO1 por 24hs concomitantemente (IU+ ZNPP), células précondicionadas com Genta e expostas ao antibiótico após 9 dias (ID), Insulto duplo associado ao indutor da HO1 (ID+HEMIN) e Insulto duplo associado ao inibidor da HO1 (ID+ZNPP). Necrose e apoptose foram avaliados, respectivamente, pelos corantes Acridina Orange/Brometo de Etídeo e Hoescht 33342. A expressão da HO1 foi realizada por Western Blot. Resultados: Ratos tratados com Genta durante 10 dias consecutivos (IU) apresentaram um aumento na creatinina plasmática, uréia, proteinúria, fração de excreção de sódio caracterizando o modelo de LRA Nefrotóxica. O PC (ID) protegeu os animais contra o aumento destes parâmetros. Observamos aumento dos peróxidos urinários, lipídicos e da proteína carbonilada no grupo IU em relação ao grupo CTL e PC (ID). Inversamente, observamos aumento da fração antioxidante do plasma, bem como aumento na imunomarcação para enzimas antioxidantes (superoxido dismutase1 e catalase) no grupo PC em relação aos demais grupos. Interessantemente, o indutor da HO1 (Hemin) potencializou estes efeitos. No principal alvo da Genta, a célula tubular proximal, o PC inibiu a morte celular por necrose e apoptose induzida pelo antibiótico, e o Hemin potencializou o efeito protetor do PC sobre a viabilidade. Conclusão: O PC protegeu os animais da LRA induzida pela Genta e esse efeito foi mediado pela inibição do estresse oxidativo, por uma ação direta na célula tubular proximal e pela indução de enzimas antioxidantes, como a HO1, que pode ser uma alternativa potencial no tratamento da LRA nefrotóxica por aminoglicosídeos.