Estudo do envolvimento da metalo-peptidase PHEX em processos tumorais

View/ Open
Date
2018-03-29Author
Neves, Raquel Leao [UNIFESP]
Advisor
Barros, Nilana Meza Tenorio De [UNIFESP]Type
Tese de doutoradoMetadata
Show full item recordAlternative Title
Study of the involvement of PHEX metallopeptidase in tumor processes.Abstract
Mutações no gene PHEX (phosphateregulating
gene with homologies to
endopeptidase on the X chromosome) resultam em uma forma prevalente (1:
20.000) de raquitismo humano hereditário denominada XLH (XLinked
Hypophosphataemia). A XLH é caracterizada por deficiência na reabsorção de
fosfato, metabolismo da vitamina D e defeitos na mineralização óssea.
Utilizando diversas metodologias e o modelo murino da XLH, o Hyp mouse,
identificamos a OPN (osteopontina) como o primeiro substrato fisiológico da
PHEX. A OPN é uma fosfoglicoproteína multifuncional com atividades tecidoespecíficas
que, dentre suas funções, pode atuar no osso como um potente
inibidor da mineralização óssea, e em tumores, como promotora da progressão
tumoral. Neste contexto, ampliamos nossos estudos desta protease no
carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSCC). No presente trabalho,
demonstramos pela primeira vez a elevada expressão de PHEX em células
tumorais não ósseas (SCC22B). Descrevemos também a modulação da OPN
tumoral (SCC22BOPN)
pela PHEX exógena, e caracterizamos a presença
temporal da proteína PHEX na membrana devido a ação de cisteínoproteases.
No intuito de progredir na compreensão do papel da PHEX nas células
SCC22B, foram realizados ensaios de colocar em português (woundhealing)
em dois diferentes modelos de células SCC22B construídos por nosso grupo,
SCC22B shRNAPHEX
(expressão do gene PHEX reduzida) e SCC22B
secPHEX (superexpressão da forma secretada da PHEX). As análises
realizadas indicaram que quando comparadas a SCC22B, a linhagem SCC22B
secPHEX apresentou redução na migração celular, enquanto que um
considerável aumento foi observado nas células SCC22B shRNAPHEX.
Recentemente, desenvolvemos também uma terceira linhagem que
superexpressa a PHEX com o domínio transmembrana íntegro (SCC22B
mbPHEX), e que está sendo caracterizada para realizar uma análise
comparativa com os outros dois modelos. Por fim, demonstramos a coexpressão
de PHEX e OPN nas células de leucemia Jurkat, Kasumi, KG1,
K562
e Lucena (modelos de tumores nãosólidos).
Os resultados obtidos
representam um avanço na caracterização funcional da PHEX, e demonstram que a sua expressão e/ou função não está restrita apenas a tecidos
mineralizados. Mutations in PHEX gene result in a prevalent (1: 20,000) form of
hereditary human rickets, the XLinked
Hypophosphataemia (XLH). XLH is
characterized by deficiency in phosphate reabsorption and vitamin D
metabolism, and defects in bone mineralization. Using several methodologies
and the murine XLH model, we identified the OPN (osteopontin) as the first
PHEX physiological substrate. OPN is a multifunctional phosphoglycoprotein
with tissuespecific
activities that, among its functions, can act in bone as a
potent inhibitor of bone mineralization, and in tumors, as a promoter of tumor
progression. Considering these data, we extended our studies of this protease
in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). In the present work, we
demonstrate for the first time the high expression of PHEX in nonbone
tumor
cells (SCC22B), and describe the modulation of tumor OPN (SCC22BOPN)
by
exogenous PHEX and characterize the temporal targeting of the PHEX protein
to SCC22B cell membrane. We have found that cysteine proteases expressed
in these cells can degrade/inactivate endogenous PHEX and the treatment of
these cells with the E64 inhibitor results in increased of PHEX in membrane and
the degradation of OPN tumor fragments (SCC22BOPN).
To better understand
the role of PHEX in SCC22B cells, proliferation and migration assays were
performed using the wound healing method in two different SCC22B cell
models constructed in our laboratory, SCC22B shRNAPHEX
(reduced PHEX
gene expression) and SCC22B secPHEX (overexpression of the secreted form
of PHEX). The analyzes performed indicated that when compared to SCC22B,
the SCC22B secPHEX cell lineage showed reduction in cell proliferation and
migration, whereas a considerable increase was observed in SCC22B shRNAPHEX
cells. In addition to these two models, recently we have also developed a
third line that overexpresses PHEX with the integral transmembrane domain
(SCC22B mbPHEX) and is being characterized by our group. Finally, using the
Jurkat, Kasumi, KG1,
K562
and Lucena cell lineages, we also demonstrated
the expression of PHEX/PHEX in leukemia cells (nonsolid
tumors). The results
obtained represent an advance in the functional characterization of PHEX, and demonstrate that its expression and/or function are not restricted only to
mineralized tissues.
Keywords
Squamous cell carcinomaOsteopontin
Tumor
Phex
Xlh
Squamous cell carcinoma,
Osteopontina
Tumor