Participação de eIF2α e sua fosforilação durante o ciclo de vida e sobrevivência de Trypanosoma

Nenhuma Miniatura disponível
Data
2018-05-29
Autores
Machado, Fabricio Castro [UNIFESP]
Orientadores
Schenkman, Sergio [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Trypanosomatids regulate their gene expression mainly at the posttranscriptional level through mRNA processing, exporting, stabilization and by the control of translation. Translation initiation can be regulated by phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2) at serine 51 of its  subunit (eIF2), which stops overall protein synthesis by decreasing the availability of ribosomes coupled with initiator tRNA. The Nterminal of eIF2α is extended in trypanosomatids, so the threonine at position 169 (T169) is the regulatory phosphorylation residue. In this thesis we evaluated eIF2 expression and phosphorylation during the life cycle of trypanosome species, especially Trypanosoma cruzi, protozoa parasite that cause Chagas disease. Initially for T. cruzi, we observed the total levels of eIF2α relatively diminished in infective and nonreplicative forms, called trypomastigotes, in comparison to forms that multiply in the intestine of the insect vector or in the interior of mammalian cells. This result is convergent with a decreased global translation in infective forms. We also found that the phosphorylation of eIF2α occurs in proliferative intracellular forms prior to differentiation into trypomastigotes. To assess the role of eIF2 regulatory phosphorylation, we generated parasites overexpressing eIF2 with substitutions on phosphorylation sites by a nonphosphorylatable alanine residue. The presence of alanine instead of T169 in overexpressing eIF2α parasites led to a deregulation in protein synthesis with constitutive expression of common trypomastigotemetacyclic proteins. The mutated parasites infected less and proliferated more slowly in cultured cells and in mice. In addition, they were more susceptible to benznidazole, suggesting that eIF2 regulatory phosphorylation can be relevant in controlling gene expression during T. cruzi infection and stress response. For this reason, we tested urea derivatives compounds which have already been used to inhibit the proliferation of cancer cells by the induction of eIF2 phosphorylation. Of 25 compounds tested, only compound I17 inhibited 50% of T. cruzi and T. brucei parasite proliferation at low concentrations (1 to 3 μM) also presenting a 10 to 20fold selectivity increase for parasites in relation to mammalian cells. I17 reversibly affected the shape of parasites, stopping its cell cycle stopped in G1 phase and arresting global translation. As this compound was less effective in T. brucei containing only eIF2α with alanine substituting T169, and seemed to be partially depended on the expression of a specific protein kinase (TbK3), we infer that I17 partially acts on the parasites through the phosphorylation of eIF2α. As a conclusion of this thesis, we have revealed that the eIF2 phosphorylation pathway is important during T. cruzi life cycle and can be explored in the understanding and the development of therapies for Chagas disease and sleep sickness.
Tripanossomatídeos regulam a expressão gênica majoritariamente em nível póstranscricional através de processamento, exportação e estabilidade dos mRNAs e pelo controle da síntese proteica. Para regular o início da síntese, o fator eucarioto de iniciação 2 (eIF2) pode ser fosforilado na serina 51 da subunidade α (eIF2), reduzindo a disponibilidade de ribossomos carregados com o tRNA iniciador e diminuindo a tradução global. Unicamente em tripanossomatídeos, o Nterminal de eIF2 é estendido reposicionando a sua fosforilação regulatória para uma treonina na posição 169 (T169). Nesta tese, foi avaliado como a fosforilação varia durante o ciclo de vida de tripanossomatídeos, em especial do Trypanosoma cruzi, protozoário parasita causador da doença de Chagas. Verificouse que em T. cruzi os níveis totais de eIF2α diminuem relativamente entre as formas infectivas e não replicativas, denominadas tripomastigotas, e as formas que se multiplicam no intestino do inseto vetor ou no interior das células de mamífero. Este resultado é convergente com a diminuição da tradução global nas formas infectivas. Também verificamos que a fosforilação de eIF2 aumenta gradualmente nas formas proliferativas intracelulares antes da diferenciação em tripomastigotas. Para avaliar o papel da regulação pela fosforilação de eIF2 no ciclo de T. cruzi, foram gerados parasitas superexpressores de eIF2α com substituições nos sítios de fosforilação por alanina, um aminoácido não fosforilável. Verificamos que a presença desse eIF2 mutado em T169 desregula a síntese proteica durante o ciclo do parasita, mantendo a expressão constitutiva de glicoproteínas comuns às formas tripomastigotasmetacíclicas. Os parasitas mutados infectam menos e proliferam mais lentamente no interior das células de cultura, resultando também em menor infectividade em camundongos. Além disso, a mutação em T169 produziu parasitas mais suscetíveis ao benznidazol, reforçando que a fosforilação de eIF2 esteja envolvida no controle da expressão gênica e na resposta ao estresse em T. cruzi. Por esta razão, testamos compostos derivados de ureia previamente utilizados para inibir a replicação de células cancerígenas através da indução de fosforilação em eIF2. De 25 compostos testados, apenas o composto I17 inibiu 50% da proliferação parasitária com concentrações entre 1 a 3 μM contra todas as formas replicativas de T. cruzi e T. brucei, além de possuir seletividade 10 a 20 vezes maior para os parasitas em relação as células de mamífero. Verificamos que I17 afeta de maneira reversível as formas replicativas, parando o ciclo celular na fase G1 e reduzindo a síntese proteica global. Como este composto foi menos eficaz em T. brucei contendo somente T169 substituída por alanina, e este efeito parece ser dependente da expressão de uma proteína quinase específica denominada TbK3, podemos inferir que sua atuação, ao menos parcialmente, é através da indução da fosforilação de eIF2α nesses parasitas. Como conclusão desta tese, revelamos que a via de fosforilação de eIF2 é importante nas transições do ciclo de vida, ao menos para o T. cruzi, e pode ser explorada no entendimento e desenvolvimentos de terapias para as doenças de Chagas e do sono.
Descrição
Citação