Avaliação da imunogenicidade de vacinas de DNA e de proteínas recombinantes do envelope dos vírus chikungunya e zika
Data
2018-05-24
Autores
Amaral, Marcelo Pires 
Orientadores
Rosa, Daniela Santoro
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Chikungunya (CHIKV) and Zika (ZIKV) viruses’ infection have rapidly enhanced
worldwide in the last decades. To date, there is no vaccine available or specific
treatment against both viruses. The viral envelope proteins of CHIKV and ZIKV are
the main immunodominant antigens of the viruses and have a crucial role during the
infection in host cells. Furthermore, E2CHIKV and EZIKV are the main target of
neutralizing antibodies against the respective viruses. In this work, we designed and
optimized synthetic genes encoding E2CHIKV and EZIKV proteins, subcloned into
pVAX1 vector to obtain the DNA vaccines (pVAX-E2CHIKV and pVAX-EZIKV) and
purified using Endofree Plasmid Giga kit (Qiagen). The recombinant proteins E2CHIKV
and EZIKV were produced as inclusion bodies in BL21(DE3) and BL21(DE3)RIL
(respectively), then purified by affinity chromatography. The immunization strategies
were performed with the homologous/heterologous prime-boost regimen, 15 days
apart, with 100 μg (100 μL final volume) of the DNA vaccines (i.m.) pVAX-E2CHIKV or
pVAX-EZIKV or with 10 μg (200 μL final volume) of the recombinant proteins (s.c.)
E2CHIKV or EZIKV in the presence of different adjuvants (50 μg poly IC, 20 μg
imiquimod or 10 μg CpG) inoculated in 6-8 weeks old female mice, C57BL/6 mice for
the vaccines against CHIKV and BALB/c mice for the vaccines against ZIKV. All mice
were bled 14 days after each immunization to evaluate specific humoral response,
and euthanized 15 days after the last dose to collect spleen and popliteal and
inguinal lymph nodes to evaluate specific cellular response. All procedures were
performed in accordance to the guidelines of the UNIFESP’s Ethics Committee and
approved under protocol number 5759150416. Among all the adjuvants evaluated,
poly IC was shown the best candidate to follow the recombinant proteins E2CHIKV and
EZIKV vaccines, inducing greater magnitude of specific humoral and cellular
responses. C57BL/6 mice immunized with the DNA vaccine pVAX-E2CHIKV in the
homologous protocol were not able to induce specific humoral response, unlike the
homologous recombinant protein (E2CHIKV + poly IC) and the heterologous (pVAXE2CHIKV
/ E2CHIKV + poly IC) vaccines that induced high specific antibody titers.
Analysis of the cellular response showed that 2 doses of the homologous DNA
vaccine pVAX-E2CHIKV was able to induce only interferon γ (IFN-γ) producing cells.
The homologous E2CHIKV + poly IC vaccine was able to induce greater magnitude response of IFN-γ producing cells and IgG anti- E2CHIKV, as well as the frequency of
germinal center (GC) B cells and T follicular helper (TFH). These cellular responses
were also observed in mice immunized with the heterologous vaccine (pVAX-E2CHIKV
/ E2CHIKV + poly IC), but to a lesser extent. BALB/c mice immunized with the
homologous DNA pVAX-EZIKV and the recombinant protein EZIKV + poly IC vaccines
had the lowest and the highest magnitude of specific humoral response, respectively.
Both heterologous vaccines (pVAX-EZIKV / EZIKV + poly IC, and vice-versa) had a
medium magnitude of specific humoral response. Although all immunization groups
elicited cellular response after the different immunization strategies, the homologous
EZIKV + poly IC vaccine was able to induce higher magnitude of IFN-γ producing cells
and IgG anti-EZIKV, higher frequency of GC B cells and TFH, proliferation and
production of the intracellular cytokines TNF-α and IFN-γ by CD4+ T lymphocytes
(LT). Overall, homologous recombinant protein E2CHIKV or EZIKV vaccines in the
presence of the poly IC adjuvant were able to induce greater magnitude of humoral
and cellular response, however heterologous vaccine strategy may be another option
to induce a better quality and range of the immune response against intracellular
pathogens.
O número de infecções causadas pelos vírus Chikungunya (CHIKV) e Zika (ZIKV) têm aumentado rapidamente em todo o mundo nas últimas décadas. Até o momento, não existe vacina ou tratamento específico contra ambos os vírus. As proteínas do envelope virais desempenham um importante papel na infecção na célula hospedeira e são os principais alvos de anticorpos neutralizantes. No presente trabalho, desenhamos e otimizamos genes sintéticos que codificam as proteínas E2CHIKV e EZIKV, que foram subclonados no vetor pVAX1 para obtenção das vacinas de DNA (pVAX-E2CHIKV e pVAX-EZIKV) e purificadas utilizando “kit” comercial Endofree Plasmid Giga (Qiagen). As proteínas recombinantes E2CHIKV e EZIKV foram produzidas em corpúsculos de inclusão em bactérias BL21(DE3) e BL21(DE3)RIL (respectivamente), sendo posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade. As estratégias de imunização foram realizadas no protocolo de indução e reforço homólogo/heterólogo, 15 dias de intervalo entre as doses, com 100 μg (em volume final de 100 μL) das vacinas de DNA (i.m.) pVAX-E2CHIKV ou pVAX-EZIKV ou com 10 μg (em volume final de 200 μL) das proteínas recombinantes (s.c.) E2CHIKV ou EZIKV na presença de diferentes adjuvantes (50 μg poly IC, 20 μg imiquimod ou 10 μg CpG) administradas em camundongos fêmeas, 6-8 semanas, das linhagens C57BL/6 para as vacinas contra CHIKV e BALB/c para as vacinas contra ZIKV. O soro dos animais foi coletado 14 dias após cada dose de imunização para avaliação da resposta imune humoral específica, e 15 dias após a última dose de imunização os camundongos foram submetidos à eutanásia para coleta do baço e linfonodos poplíteos e inguinais para avaliação da resposta imune celular específica. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes da Comissão de Ética no Uso de Animais da UNIFESP e aprovado sob o protocolo 5759150416. Entre os adjuvantes avaliados, o poly IC se mostrou o melhor candidato para acompanhar as vacinas de proteínas recombinantes E2CHIKV ou EZIKV, induzindo maior magnitude de resposta humoral e celular específicas. Camundongos C57BL/6 imunizados no protocolo homólogo com a vacina de DNA pVAX-E2CHIKV não foi capaz de induzir resposta humoral específica, diferentemente das imunizações homóloga de proteína recombinante (E2CHIKV + poly IC) e heteróloga (pVAX-E2CHIKV / E2CHIKV) que induziram altos títulos de anticorpos específicos. A análise da resposta celular mostrou que 2 doses da vacina homóloga de DNA pVAX-E2CHIKV foi capaz de induzir somente células produtoras de interferon γ (IFN-γ). A vacina homóloga E2CHIKV + poly IC foi capaz de induzir maior magnitude de resposta de células produtoras de IFN-γ e IgG anti-E2CHIKV, e também maior frequência de células B do centro germinativo (CG) e de células T auxiliares foliculares (TFH). Estas respostas celulares também foram observadas nos camundongos imunizados com a vacina heteróloga (pVAXE2CHIKV / E2CHIKV), porém em menor magnitude. Camundongos BALB/c imunizados com as vacinas homólogas de DNA pVAX-EZIKV e de proteína recombinante EZIKV + poly IC tiveram a menor e maior magnitude de resposta humoral específica, respectivamente. Ambas as vacinas heterólogas (pVAX-EZIKV / EZIKV + poly IC, e vice-versa) tiveram magnitude mediana de resposta humoral específica. Contudo, todos os grupos de imunização apresentarem resposta celular após as diferentes estratégias de imunização, a vacina homóloga EZIKV + poly IC foi capaz de induzir maior magnitude de células produtoras de IFN-γ e IgG anti-EZIKV, maior frequência de células B do CG e de células TFH, proliferação e produção das citocinas intracelulares TNF-α e IFN-γ por linfócitos T (LT) CD4+. No geral, as vacinas homólogas de proteína recombinante E2CHIKV ou EZIKV na presença do adjuvante poly IC foram capazes de induzir maior magnitude de resposta humoral e celular, entretanto uma estratégia de vacina heteróloga pode ser uma alternativa para induzir maior qualidade e abrangência da resposta imune contra patógenos intracelulares.
O número de infecções causadas pelos vírus Chikungunya (CHIKV) e Zika (ZIKV) têm aumentado rapidamente em todo o mundo nas últimas décadas. Até o momento, não existe vacina ou tratamento específico contra ambos os vírus. As proteínas do envelope virais desempenham um importante papel na infecção na célula hospedeira e são os principais alvos de anticorpos neutralizantes. No presente trabalho, desenhamos e otimizamos genes sintéticos que codificam as proteínas E2CHIKV e EZIKV, que foram subclonados no vetor pVAX1 para obtenção das vacinas de DNA (pVAX-E2CHIKV e pVAX-EZIKV) e purificadas utilizando “kit” comercial Endofree Plasmid Giga (Qiagen). As proteínas recombinantes E2CHIKV e EZIKV foram produzidas em corpúsculos de inclusão em bactérias BL21(DE3) e BL21(DE3)RIL (respectivamente), sendo posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade. As estratégias de imunização foram realizadas no protocolo de indução e reforço homólogo/heterólogo, 15 dias de intervalo entre as doses, com 100 μg (em volume final de 100 μL) das vacinas de DNA (i.m.) pVAX-E2CHIKV ou pVAX-EZIKV ou com 10 μg (em volume final de 200 μL) das proteínas recombinantes (s.c.) E2CHIKV ou EZIKV na presença de diferentes adjuvantes (50 μg poly IC, 20 μg imiquimod ou 10 μg CpG) administradas em camundongos fêmeas, 6-8 semanas, das linhagens C57BL/6 para as vacinas contra CHIKV e BALB/c para as vacinas contra ZIKV. O soro dos animais foi coletado 14 dias após cada dose de imunização para avaliação da resposta imune humoral específica, e 15 dias após a última dose de imunização os camundongos foram submetidos à eutanásia para coleta do baço e linfonodos poplíteos e inguinais para avaliação da resposta imune celular específica. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes da Comissão de Ética no Uso de Animais da UNIFESP e aprovado sob o protocolo 5759150416. Entre os adjuvantes avaliados, o poly IC se mostrou o melhor candidato para acompanhar as vacinas de proteínas recombinantes E2CHIKV ou EZIKV, induzindo maior magnitude de resposta humoral e celular específicas. Camundongos C57BL/6 imunizados no protocolo homólogo com a vacina de DNA pVAX-E2CHIKV não foi capaz de induzir resposta humoral específica, diferentemente das imunizações homóloga de proteína recombinante (E2CHIKV + poly IC) e heteróloga (pVAX-E2CHIKV / E2CHIKV) que induziram altos títulos de anticorpos específicos. A análise da resposta celular mostrou que 2 doses da vacina homóloga de DNA pVAX-E2CHIKV foi capaz de induzir somente células produtoras de interferon γ (IFN-γ). A vacina homóloga E2CHIKV + poly IC foi capaz de induzir maior magnitude de resposta de células produtoras de IFN-γ e IgG anti-E2CHIKV, e também maior frequência de células B do centro germinativo (CG) e de células T auxiliares foliculares (TFH). Estas respostas celulares também foram observadas nos camundongos imunizados com a vacina heteróloga (pVAXE2CHIKV / E2CHIKV), porém em menor magnitude. Camundongos BALB/c imunizados com as vacinas homólogas de DNA pVAX-EZIKV e de proteína recombinante EZIKV + poly IC tiveram a menor e maior magnitude de resposta humoral específica, respectivamente. Ambas as vacinas heterólogas (pVAX-EZIKV / EZIKV + poly IC, e vice-versa) tiveram magnitude mediana de resposta humoral específica. Contudo, todos os grupos de imunização apresentarem resposta celular após as diferentes estratégias de imunização, a vacina homóloga EZIKV + poly IC foi capaz de induzir maior magnitude de células produtoras de IFN-γ e IgG anti-EZIKV, maior frequência de células B do CG e de células TFH, proliferação e produção das citocinas intracelulares TNF-α e IFN-γ por linfócitos T (LT) CD4+. No geral, as vacinas homólogas de proteína recombinante E2CHIKV ou EZIKV na presença do adjuvante poly IC foram capazes de induzir maior magnitude de resposta humoral e celular, entretanto uma estratégia de vacina heteróloga pode ser uma alternativa para induzir maior qualidade e abrangência da resposta imune contra patógenos intracelulares.