Participação da formação hipocampal dorsal na modulação do medo condicionado: análise comportamental e proteica
Data
2018-09-20
Autores
Gaiardo, Renan Barretta 
Orientadores
Cerutti, Suzete Maria
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Behavioral and molecular data from our laboratory showed that the hippocampal
formation participates in the formation of the memory of the conditioned suppression
of the licking response. However, it does not clarify the molecular substrates involved
in the different stages of the memory formation, evocation and extinction, and the
process of long-term memory transfer from the hippocampus to other cortical structures. In this sense, the objective of this work was to study the protein alterations underlying the acquisition, evocation and extinction of conditioned fear memory in the dorsal and ventral hippocampal formation of rats submitted to the suppression of the licking response. For this study, male Wistar rats, randomly distributed in ten experimental groups and divided into two experiments, were used. After acquisition of the lick response (5 days), each rat was submitted to four associations between soundshock with five minutes interval (6th day). Suppression of licking behavior was measured by consecutive CS presentations in the test. The time taken to complete 10 licks in the presence and absence of CS in the test was used to calculate the suppression rate (SR) for each animal. For experiment 1, the protein profile of the dorsal hippocampal formation of the animals tested 2 or 40 days after conditioning and with euthanasia time of 24 hours after the test were compared. The data show that animals have acquired the memory of conditioned fear and that this event is gaining a new meaning over time, the sound fails to indicate something dangerous and retakes its original meaning. They also show for the first time that the test performed 40 days after the training does not interfere in the retention of the task, considering that the animals presented TS values equal to the other controls. Protein profile analysis resulted in 1,165 identified proteins and 265 quantified proteins, 38 of which had significant differential expression and seven proteins were unique. Protein interaction analysis indicated changes in myelin sheath pathways, neuronal generation and differentiation, regulation of neurogenesis and synaptic vesicle transport, axonal development, and the growth cone. For the experiment 2, we analyzed the expression of seven different signal transduction pathways in two euthanasia times (1 and 24 hours) in different stages of the experimental protocol: training, acquisition retention test (1 or 10 trials) and extinction retention test. The data indicated that the acquisition, consolidation and extinction of conditioned suppression comprises morphological changes in the dorsal and ventral hippocampal formation and alter the expression of BDNF, calcineurin A, CaMKII, calcium channel, CREB, PI3K and PKC, proteins that are involved in the long-term potentiation, the main cellular alteration for the consolidation of memories.
Dados comportamentais e moleculares de nosso laboratório evidenciaram que a formação hipocampal participa da formação da memória da supressão condicionada da resposta de lamber. Porém, não esclarece sobre os substratos moleculares envolvidos nas diferentes etapas do processo de formação e de evocação da memória estudada, na sua extinção e no processo de transferência de memória a longo prazo do hipocampo para outras estruturas corticais. Neste sentido, o objeto do trabalho foi estudar as alterações proteicas subjacente à aquisição, evocação e extinção da memória do medo condicionado na formação hipocampal dorsal e ventral de ratos submetidos ao teste da supressão da resposta de lamber. Para este estudo, foram utilizados ratos Wistar, machos, adultos, distribuídos aleatoriamente em dez grupos, divididos em dois experimentos. Após a aquisição da resposta de lamber (5 dias), cada rato era submetido a quatro associações entre som-choque com cinco minutos de intervalo (6º dia). A supressão do comportamento de lamber foi medida através de consecutivas apresentações do EC, no teste. O tempo utilizado para completar 10 lambidas na presença e na ausência do EC, no teste, foi utilizado para cálculo da taxa de supressão (TS) para cada animal. Para o experimento 1, foi comparado o perfil proteico da formação hipocampal dorsal dos animais testados 2 ou 40 dias após o condicionamento e com tempo de eutanásia de 24 horas após o teste. Os dados mostram que os animais adquiriram a memória do medo condicionado e que este evento vai ganhando um novo significado ao longo do tempo, o som deixa de indicar algo perigoso e retoma o seu significado original. Ainda mostram pela primeira vez que o teste realizado 40 dias após o treino não interfere na retenção da tarefa, considerando que os animais apresentaram valores da TS iguais aos demais controles. A análise do perfil proteico resultou em 1.165 proteínas identificadas e 265 quantificadas, sendo que 38 tiveram expressão diferencial significante e sete proteínas foram exclusivas. A análise de interação de proteínas indicou alterações nas vias de bainha de mielina, geração e diferenciação neuronal, regulação da neurogênese e do transporte de vesículas sinápticas, desenvolvimento axonal e o cone de crescimento. Para o experimento 2, foi analisada a expressão de sete proteínas de vias distintas de transdução de sinal em dois tempos de eutanásia (1 e 24 horas) em diferentes etapas do protocolo experimental: condicionamento, teste de retenção da aquisição (1 ou 10 tentativas) e teste da retenção da extinção. Os dados indicaram que a aquisição, consolidação e extinção da supressão condicionada compreende em mudanças morfológicas na formação hipocampal dorsal e ventral e altera a expressão de BDNF, calcineurina A, CaMKII, canal de cálcio, CREB, PI3K e PKC, proteínas que estão envolvidas na potenciação a longo prazo, principal alteração celular para a consolidação das memórias.
Dados comportamentais e moleculares de nosso laboratório evidenciaram que a formação hipocampal participa da formação da memória da supressão condicionada da resposta de lamber. Porém, não esclarece sobre os substratos moleculares envolvidos nas diferentes etapas do processo de formação e de evocação da memória estudada, na sua extinção e no processo de transferência de memória a longo prazo do hipocampo para outras estruturas corticais. Neste sentido, o objeto do trabalho foi estudar as alterações proteicas subjacente à aquisição, evocação e extinção da memória do medo condicionado na formação hipocampal dorsal e ventral de ratos submetidos ao teste da supressão da resposta de lamber. Para este estudo, foram utilizados ratos Wistar, machos, adultos, distribuídos aleatoriamente em dez grupos, divididos em dois experimentos. Após a aquisição da resposta de lamber (5 dias), cada rato era submetido a quatro associações entre som-choque com cinco minutos de intervalo (6º dia). A supressão do comportamento de lamber foi medida através de consecutivas apresentações do EC, no teste. O tempo utilizado para completar 10 lambidas na presença e na ausência do EC, no teste, foi utilizado para cálculo da taxa de supressão (TS) para cada animal. Para o experimento 1, foi comparado o perfil proteico da formação hipocampal dorsal dos animais testados 2 ou 40 dias após o condicionamento e com tempo de eutanásia de 24 horas após o teste. Os dados mostram que os animais adquiriram a memória do medo condicionado e que este evento vai ganhando um novo significado ao longo do tempo, o som deixa de indicar algo perigoso e retoma o seu significado original. Ainda mostram pela primeira vez que o teste realizado 40 dias após o treino não interfere na retenção da tarefa, considerando que os animais apresentaram valores da TS iguais aos demais controles. A análise do perfil proteico resultou em 1.165 proteínas identificadas e 265 quantificadas, sendo que 38 tiveram expressão diferencial significante e sete proteínas foram exclusivas. A análise de interação de proteínas indicou alterações nas vias de bainha de mielina, geração e diferenciação neuronal, regulação da neurogênese e do transporte de vesículas sinápticas, desenvolvimento axonal e o cone de crescimento. Para o experimento 2, foi analisada a expressão de sete proteínas de vias distintas de transdução de sinal em dois tempos de eutanásia (1 e 24 horas) em diferentes etapas do protocolo experimental: condicionamento, teste de retenção da aquisição (1 ou 10 tentativas) e teste da retenção da extinção. Os dados indicaram que a aquisição, consolidação e extinção da supressão condicionada compreende em mudanças morfológicas na formação hipocampal dorsal e ventral e altera a expressão de BDNF, calcineurina A, CaMKII, canal de cálcio, CREB, PI3K e PKC, proteínas que estão envolvidas na potenciação a longo prazo, principal alteração celular para a consolidação das memórias.