Análise do padrão de metilação das regiões line-1 de pacientes em primeiro episódio psicótico

Abstract

Schizophrenia is mainly characterized by psychosis (positive symptoms) such as delusions and hallucinations. The disorder may also involve negative symptoms (such as affective blunting), as well as cognitive impairment. The etiology of the disease is unclear, and the investigation of epigenetic mechanisms may be a pathway to better understand the pathophysiology and response to treatment of psychotic disorders. In the genome, repetitive regions, including the LINE1 (long interspersed nuclear element1) region, are susceptible to methylation of CpGs sites, and constitute a target for the evaluation of global methylation patterns, since they represent approximately 17% of human genome. Thus, the main hypothesis of this work would be that antipsychoticnaïve first episode psychosis (FEP) patients would have hypomethylation of the analyzed regions and, after risperidone treatment, the methylation patterns can be recovered in individuals who responded well to the drug. In addition, we anticipate finding an association of the clinical aspects of each patient with the applied psychiatric scales and the LINE1 methylation, so that we may in future use methylation levels as biological predictors of response. In this context, the present project aimed to evaluate the methylation of three LINE1 CpGs sites located in the 5'UTR promoter region in peripheral blood of 76 antipsychoticnaïve FEP patients and 62 healthy controls in order to understand the role of global methylation in the pathophysiology of schizophrenia. In addition, this project also aimed to evaluate possible changes in methylation related to treatment with risperidone (atypical antipsychotic) through a longitudinal study, following up these modifications in the patients for a period of two months. Recently, LINE1 has been a target of several studies related to neurodevelopment. Changes in its methylation are usually associated with genomic instability. To carry out the study, we started with blood samples collection from individuals and then with the DNA isolation followed by sodium bisulfite conversion. In this method, the DNA treated with bisulfite has the unmethylated cytosines converted into uracils whereas the methylated cytosines are not chemically modified and remain as cytosines. After conversion, the LINE1 (146 bp) fragments containing three CpGs are amplified using conventional PCR and subsequently sequenced using the pyrosequencing technique. Pyrosequencing consists of luminous signal registers by enzymatic reactions that generate peaks that are proportional to the number of nucleotides incorporated in the DNA strand. Finally, the step of methylation quantification was performed and then the methylation levels were compared among the groups. We found hypomethylation in FEP patients in all regions analyzed when compared to the control group, suggesting that LINE1 might be associated with the etiology of psychosis. After paired analysis to compare methylation before and after treatment, we observed that methylation means were higher after treatment with risperidone, although it was not statistically significant. Interestingly, we found a positive correlation in LINE1 CpG1 region and the response to the positive symptoms of FEP patients treated with risperidone, suggesting that nonresponders would have hypomethylation when compared to responders, which may be, in future, an important biological marker of prediction. This work brings new insights about the characterization of the methylation pattern of LINE1 CpGs sites in FEP patients, correlating methylation levels with clinical aspects.

A esquizofrenia é caracterizada principalmente pela psicose (sintomas positivos), como delírios e alucinações. O quadro pode ainda envolver sintomas negativos (como embotamento afetivo), além de prejuízos cognitivos. A etiologia da doença não é clara e a investigação de mecanismos epigenéticos pode ser um caminho para ajudar a esclarecer a fisiopatologia e a resposta ao tratamento de transtornos psicóticos. No genoma, regiões de repetição, incluindo a região LINE1 (long interspersed nuclear element1), são suscetíveis à metilação de sítios CpGs, e configuram um alvo para a avaliação dos padrões globais de metilação, já que representam aproximadamente 17% do genoma humano. Neste trabalho, a principal hipótese levantada é a de que pacientes em primeiro episódio psicótico (PEP) virgens de tratamento teriam uma hipometilação das regiões analisadas em relação a controles saudáveis e que, após o tratamento com risperidona, os padrões de metilação possam ser recuperados em indivíduos que responderam bem ao medicamento. Além disso, esperamos encontrar uma associação dos aspectos clínicos com a metilação de LINE1, de maneira que possamos, futuramente, utilizar os níveis de metilação como marcadores biológicos de predição de gravidade e de resposta. Neste contexto, o presente projeto se propôs avaliar a metilação de três sítios CpGs de LINE1 localizados na região promotora 5’UTR em sangue periférico de 76 pacientes em PEP virgens de antipsicóticos e 62 controles, a fim de compreender o papel da metilação global na fisiopatologia da esquizofrenia. Além disso, este projeto se propôs também avaliar possíveis alterações na metilação relacionadas ao tratamento com risperidona (antipsicótico atípico) por meio de um estudo longitudinal, acompanhando essas modificações nos pacientes pelo período de dois meses. Recentemente, LINE1 tem sido alvo de muitas pesquisas relacionadas com o neurodesenvolvimento. Alterações na sua metilação normalmente estão associadas à instabilidade genômica. Para a realização do estudo, iniciamos com a coleta de sangue dos indivíduos e, em seguida, com o isolamento do DNA que foi convertido utilizando o bissulfito de sódio. Neste método, o DNA tratado com bissulfito tem as citosinas não metiladas convertidas em uracilas enquanto que as citosinas metiladas não são modificadas quimicamente e permanecem como citosinas. Após a conversão, os fragmentos de LINE1(146 pb) contendo três CpGs são amplificados por meio de PCR convencional e, posteriormente, são sequenciados utilizando a técnica de pirosequenciamento. O pirosequenciamento consiste em registros de sinais luminosos por reações enzimáticas que geram picos proporcionais ao número de nucleotídeos incorporados na fita de DNA. Por fim, realizase a etapa de quantificação da metilação e, então, os níveis de metilação são comparados entre os grupos. Encontramos hipometilação nos pacientes em PEP em todas as regiões analisadas quando comparadas ao grupo controle, sugerindo que LINE1 possa estar associada à etiologia da psicose. Após análise pareada para comparar a metilação antes e após o tratamento, observamos que as médias de metilação subiram após o tratamento com a risperidona, embora não tenha sido estatisticamente significante. Outro resultado interessante foi a correlação positiva encontrada entre a região CpG1 de LINE1 e a resposta aos sintomas positivos dos pacientes em PEP tratados com risperidona, sugerindo que os nãorespondedores teriam hipometilação quando comparados aos respondedores, podendo ser, futuramente, um importante marcador biológico de predição de resposta a partir de mais estudos. Este trabalho trouxe, portanto, novos conhecimentos sobre a caracterização do padrão de metilação de sítios CpGs de LINE1 em pacientes em PEP, correlacionando os níveis de metilação com aspectos clínicos.