Análise do padrão de metilação das regiões line-1 de pacientes em primeiro episódio psicótico
Data
2018-08-30
Autores
Marques, Diogo Ferri 
Orientadores
Belangero, Sintia Iole Nogueira
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Schizophrenia is mainly characterized by psychosis (positive symptoms) such
as delusions and hallucinations. The disorder may also involve negative symptoms
(such as affective blunting), as well as cognitive impairment. The etiology of the
disease is unclear, and the investigation of epigenetic mechanisms may be a pathway
to better understand the pathophysiology and response to treatment of psychotic
disorders. In the genome, repetitive regions, including the LINE1
(long interspersed
nuclear element1)
region, are susceptible to methylation of CpGs sites, and constitute
a target for the evaluation of global methylation patterns, since they represent
approximately 17% of human genome. Thus, the main hypothesis of this work would
be that antipsychoticnaïve
first episode psychosis (FEP) patients would have
hypomethylation of the analyzed regions and, after risperidone treatment, the
methylation patterns can be recovered in individuals who responded well to the drug.
In addition, we anticipate finding an association of the clinical aspects of each patient
with the applied psychiatric scales and the LINE1
methylation, so that we may in future
use methylation levels as biological predictors of response. In this context, the present
project aimed to evaluate the methylation of three LINE1
CpGs sites located in the
5'UTR promoter region in peripheral blood of 76 antipsychoticnaïve
FEP patients and
62 healthy controls in order to understand the role of global methylation in the
pathophysiology of schizophrenia. In addition, this project also aimed to evaluate
possible changes in methylation related to treatment with risperidone (atypical
antipsychotic) through a longitudinal study, following up these modifications in the
patients for a period of two months. Recently, LINE1
has been a target of several
studies related to neurodevelopment. Changes in its methylation are usually
associated with genomic instability. To carry out the study, we started with blood
samples collection from individuals and then with the DNA isolation followed by sodium
bisulfite conversion. In this method, the DNA treated with bisulfite has the
unmethylated cytosines converted into uracils whereas the methylated cytosines are
not chemically modified and remain as cytosines. After conversion, the LINE1
(146
bp) fragments containing three CpGs are amplified using conventional PCR and
subsequently sequenced using the pyrosequencing technique. Pyrosequencing
consists of luminous signal registers by enzymatic reactions that generate peaks that
are proportional to the number of nucleotides incorporated in the DNA strand. Finally, the step of methylation quantification was performed and then the methylation levels
were compared among the groups. We found hypomethylation in FEP patients in all
regions analyzed when compared to the control group, suggesting that LINE1
might
be associated with the etiology of psychosis. After paired analysis to compare
methylation before and after treatment, we observed that methylation means were
higher after treatment with risperidone, although it was not statistically significant.
Interestingly, we found a positive correlation in LINE1
CpG1 region and the response
to the positive symptoms of FEP patients treated with risperidone, suggesting that nonresponders
would have hypomethylation when compared to responders, which may
be, in future, an important biological marker of prediction. This work brings new insights
about the characterization of the methylation pattern of LINE1
CpGs sites in FEP
patients, correlating methylation levels with clinical aspects.
A esquizofrenia é caracterizada principalmente pela psicose (sintomas positivos), como delírios e alucinações. O quadro pode ainda envolver sintomas negativos (como embotamento afetivo), além de prejuízos cognitivos. A etiologia da doença não é clara e a investigação de mecanismos epigenéticos pode ser um caminho para ajudar a esclarecer a fisiopatologia e a resposta ao tratamento de transtornos psicóticos. No genoma, regiões de repetição, incluindo a região LINE1 (long interspersed nuclear element1), são suscetíveis à metilação de sítios CpGs, e configuram um alvo para a avaliação dos padrões globais de metilação, já que representam aproximadamente 17% do genoma humano. Neste trabalho, a principal hipótese levantada é a de que pacientes em primeiro episódio psicótico (PEP) virgens de tratamento teriam uma hipometilação das regiões analisadas em relação a controles saudáveis e que, após o tratamento com risperidona, os padrões de metilação possam ser recuperados em indivíduos que responderam bem ao medicamento. Além disso, esperamos encontrar uma associação dos aspectos clínicos com a metilação de LINE1, de maneira que possamos, futuramente, utilizar os níveis de metilação como marcadores biológicos de predição de gravidade e de resposta. Neste contexto, o presente projeto se propôs avaliar a metilação de três sítios CpGs de LINE1 localizados na região promotora 5’UTR em sangue periférico de 76 pacientes em PEP virgens de antipsicóticos e 62 controles, a fim de compreender o papel da metilação global na fisiopatologia da esquizofrenia. Além disso, este projeto se propôs também avaliar possíveis alterações na metilação relacionadas ao tratamento com risperidona (antipsicótico atípico) por meio de um estudo longitudinal, acompanhando essas modificações nos pacientes pelo período de dois meses. Recentemente, LINE1 tem sido alvo de muitas pesquisas relacionadas com o neurodesenvolvimento. Alterações na sua metilação normalmente estão associadas à instabilidade genômica. Para a realização do estudo, iniciamos com a coleta de sangue dos indivíduos e, em seguida, com o isolamento do DNA que foi convertido utilizando o bissulfito de sódio. Neste método, o DNA tratado com bissulfito tem as citosinas não metiladas convertidas em uracilas enquanto que as citosinas metiladas não são modificadas quimicamente e permanecem como citosinas. Após a conversão, os fragmentos de LINE1(146 pb) contendo três CpGs são amplificados por meio de PCR convencional e, posteriormente, são sequenciados utilizando a técnica de pirosequenciamento. O pirosequenciamento consiste em registros de sinais luminosos por reações enzimáticas que geram picos proporcionais ao número de nucleotídeos incorporados na fita de DNA. Por fim, realizase a etapa de quantificação da metilação e, então, os níveis de metilação são comparados entre os grupos. Encontramos hipometilação nos pacientes em PEP em todas as regiões analisadas quando comparadas ao grupo controle, sugerindo que LINE1 possa estar associada à etiologia da psicose. Após análise pareada para comparar a metilação antes e após o tratamento, observamos que as médias de metilação subiram após o tratamento com a risperidona, embora não tenha sido estatisticamente significante. Outro resultado interessante foi a correlação positiva encontrada entre a região CpG1 de LINE1 e a resposta aos sintomas positivos dos pacientes em PEP tratados com risperidona, sugerindo que os nãorespondedores teriam hipometilação quando comparados aos respondedores, podendo ser, futuramente, um importante marcador biológico de predição de resposta a partir de mais estudos. Este trabalho trouxe, portanto, novos conhecimentos sobre a caracterização do padrão de metilação de sítios CpGs de LINE1 em pacientes em PEP, correlacionando os níveis de metilação com aspectos clínicos.
A esquizofrenia é caracterizada principalmente pela psicose (sintomas positivos), como delírios e alucinações. O quadro pode ainda envolver sintomas negativos (como embotamento afetivo), além de prejuízos cognitivos. A etiologia da doença não é clara e a investigação de mecanismos epigenéticos pode ser um caminho para ajudar a esclarecer a fisiopatologia e a resposta ao tratamento de transtornos psicóticos. No genoma, regiões de repetição, incluindo a região LINE1 (long interspersed nuclear element1), são suscetíveis à metilação de sítios CpGs, e configuram um alvo para a avaliação dos padrões globais de metilação, já que representam aproximadamente 17% do genoma humano. Neste trabalho, a principal hipótese levantada é a de que pacientes em primeiro episódio psicótico (PEP) virgens de tratamento teriam uma hipometilação das regiões analisadas em relação a controles saudáveis e que, após o tratamento com risperidona, os padrões de metilação possam ser recuperados em indivíduos que responderam bem ao medicamento. Além disso, esperamos encontrar uma associação dos aspectos clínicos com a metilação de LINE1, de maneira que possamos, futuramente, utilizar os níveis de metilação como marcadores biológicos de predição de gravidade e de resposta. Neste contexto, o presente projeto se propôs avaliar a metilação de três sítios CpGs de LINE1 localizados na região promotora 5’UTR em sangue periférico de 76 pacientes em PEP virgens de antipsicóticos e 62 controles, a fim de compreender o papel da metilação global na fisiopatologia da esquizofrenia. Além disso, este projeto se propôs também avaliar possíveis alterações na metilação relacionadas ao tratamento com risperidona (antipsicótico atípico) por meio de um estudo longitudinal, acompanhando essas modificações nos pacientes pelo período de dois meses. Recentemente, LINE1 tem sido alvo de muitas pesquisas relacionadas com o neurodesenvolvimento. Alterações na sua metilação normalmente estão associadas à instabilidade genômica. Para a realização do estudo, iniciamos com a coleta de sangue dos indivíduos e, em seguida, com o isolamento do DNA que foi convertido utilizando o bissulfito de sódio. Neste método, o DNA tratado com bissulfito tem as citosinas não metiladas convertidas em uracilas enquanto que as citosinas metiladas não são modificadas quimicamente e permanecem como citosinas. Após a conversão, os fragmentos de LINE1(146 pb) contendo três CpGs são amplificados por meio de PCR convencional e, posteriormente, são sequenciados utilizando a técnica de pirosequenciamento. O pirosequenciamento consiste em registros de sinais luminosos por reações enzimáticas que geram picos proporcionais ao número de nucleotídeos incorporados na fita de DNA. Por fim, realizase a etapa de quantificação da metilação e, então, os níveis de metilação são comparados entre os grupos. Encontramos hipometilação nos pacientes em PEP em todas as regiões analisadas quando comparadas ao grupo controle, sugerindo que LINE1 possa estar associada à etiologia da psicose. Após análise pareada para comparar a metilação antes e após o tratamento, observamos que as médias de metilação subiram após o tratamento com a risperidona, embora não tenha sido estatisticamente significante. Outro resultado interessante foi a correlação positiva encontrada entre a região CpG1 de LINE1 e a resposta aos sintomas positivos dos pacientes em PEP tratados com risperidona, sugerindo que os nãorespondedores teriam hipometilação quando comparados aos respondedores, podendo ser, futuramente, um importante marcador biológico de predição de resposta a partir de mais estudos. Este trabalho trouxe, portanto, novos conhecimentos sobre a caracterização do padrão de metilação de sítios CpGs de LINE1 em pacientes em PEP, correlacionando os níveis de metilação com aspectos clínicos.