Complexo Candida guilliermondii: identificação molecular, prevalência de espécies de interesse clínico e susceptibilidade aos antifúngicos
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Data
2018-06-28
Autores
Pedoni, Diego Betto [UNIFESP]
Orientadores
Colombo, Arnaldo Lopes [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Candida guilliermondii today represents a complex of emerging species, some of them of clinical importance, having been described in 1912 by Castellani et al., from sputum culture of a patient with bronchial infection. It is currently responsible for 1-25% of the bloodstream infections caused by Candida sp. in different geographic regions. Despite biological variation of this complex in the world, these isolates of C. guilliermondii are characterized as a single taxonomic unit when identified by phenotypic methods. However, the molecular analysis of genomic DNA allows the
differentiation of 7 distinct species in this complex: C. guilliermondii sensu stricto (Meyerozyma guilliermondii), C. fermentati (Meyerozyma carribicca), C. smithsonii, C. athensensis, C. elateridarum, C. carpophila and C. glucosophila. To date, only three species of the complex have been associated with infections in humans: C. guilliermondii, C. fermentati and C. carpophila. There are few data on putative biological and clinical peculiarities of the infections caused by the species of this complex, and their prevalence in medical centers in Brazil and Latin America is unknown. Objectives: To determine the prevalence of different species of the C. guilliermondii complex in episodes of candidemia sequentially documented in sentinel medical centers, standardize strategies for identifying species of the complex and to assess the in vitro susceptibility profile to antifungal of these agents isolates. Material and Methods: A total of 150 isolates obtained from patients attended at 18 medical centers in Brazil and Latin America, initially identified as belonging to C. guilliermondii complex, were submitted to identification by sequencing of the ITS rDNA regions. For the RFLP a PCR of the ITS region of the rDNA was performed, and the amplified DNA fragment was digested with the enzyme Taq I. Refering to the proteomic profile of these isolates, the protein profiles were obtained on the Bruker Daltonics system and assembly of the in-house library. In vitro susceptibility tests were performed according to CLSI document M27-A3 and M27-S4, using antifungal the agents: amphotericin B (AMB), fluconazole (FLC), voriconazole (VOR) and anidulafungina (AND). Results: Among the 150 isolates studied, 135 isolates were identified as C. guilliermondii sensu stricto, 13 isolates as C. fermentati and 2 isolates as C. carpophila. Acording the RFLP assay, it was possible to verify that C. guilliermondii sensu stricto isolates presented a banding profile with 2 bands (~ 250 and 190 bp) and C. fermentati and C. carpophila with 3 bands (~ 250.190 and 150 bp). We created a robust proteomic database with 5 profiles of C. guilliermondii and C. fermentati isolates. In general, in the antifungal susceptibility tests, C. fermentati isolates presented higher geometric means of MICs for FLC, AND and AMB (3.79 μg / mL, 2.11 μg / mL and 1 μg / mL, respectively) ) compared to C. guilliermondii sensu stricto (2.70 μg / mL, 1.77 μg / mL and 0.66 μg / mL, respectively). For the MIC values for VOR, both obtained the same geometric mean of 1 μg / mL. Conclusion: Sequencing of regions of the ribosomal gene allowed accurate identification of all the isolates tested. Using the RFLP technique it was possible to discriminate C. guilliermondii sensu stricto from C. fermentati, but it was not possible to discriminate C. carpohila from C. fermentati. We created a proteomic database capable to discriminate isolates of C. guilliermondii sensu stricto and C. fermentati. In the study, the clinical isolates of C. fermentati presented lower susceptibility to the antifungal agents FLC, AND and AMB, when compared to C. guilliermondii sensu stricto isolates.
Candida guilliermondii representa hoje um complexo de espécies emergentes, algumas delas com importância clínica, tendo sido descrita em 1912 por Castellani et al., a partir de cultivo de escarro de paciente com infecção brônquica. Atualmente é responsável por 1-25% das infecções de corrente sanguínea causadas por Candida sp. em diferentes regiões geográficas. A despeito das variações biológicas deste complexo, na vida real, estes isolados de C. guilliermondii são caracterizados como unidade taxonômica única quando identificados por métodos fenotípicos. Entretanto, a análise molecular do DNA genômico permite a diferenciação de 7 espécies distintas neste complexo: C. guilliermondii sensu stricto (Meyerozyma guilliermondii), C. fermentati (Meyerozyma carribicca), C. smithsonii, C. athensensis, C. elateridarum, C. carpophila e C. glucosophila. Até o momento, apenas três espécies do complexo foram associadas a infecções em humanos: C. guilliermondii, C. fermentati e C. carpophila. Há poucos dados sobre putativas peculiaridades biológicas e clínicas das infecções causadas pelas espécies deste complexo, sendo desconhecida sua prevalência em centros médicos no Brasil e América Latina. Objetivos: Determinar a prevalência de diferentes espécies do complexo Candida guilliermondii em episódios de candidemia sequencialmente documentados em centros médicos sentinelas, padronizar estratégia de identificação de espécies do complexo e avaliar o perfil de susceptibilidade in vitro a antifúngicos destes isolados. Material e Métodos: Um total de 150 isolados obtidos de pacientes com fungemia atendidos em 18 centros médicos do Brasil e América Latina, inicialmente identificados como pertencentes ao complexo C. guilliermondii foram submetidos a identificação por sequenciamento das regiões ITS do rDNA. Para o RFLP foi realizado uma PCR da região ITS do rDNA, e o fragmento do DNA amplificado foi submetido a uma digestão com a enzima Taq I. Em relação ao perfil proteômico destes isolados, a aquisição do perfil proteico foi realizada no sistema Bruker Daltonics com montagem da biblioteca in-house. Os testes de susceptibilidade in vitro foram realizados de acordo com documento M27-A3 e M27-S4 do CLSI, utilizando os antifúngicos: anfotericina B (AMB), fluconazol (FLC), voriconazol (VOR) e anidulafungina (AND). Resultados: Entre os 150 isolados estudados, 135 isolados foram identificados como C. guilliermondii sensu stricto, 13 isolados como C. fermentati e 2 isolados como C. carpophila. Utilizando ensaio de RFLP foi possível constatar que os isolados de C. guilliermondii sensu stricto apresentaram um perfil de bandeamento com 2 bandas (~250 e 190 pb) e C. fermentati e C. carpophila com 3 bandas (~250,190 e 150pb). Criamos um banco proteômico robusto com 5 perfis de isolados das espécies C. guilliermondii sensu stricto e C. fermentati. Em geral, nos testes de sensibilidade aos antifúngicos, os isolados de C. fermentati apresentaram médias geométricas de CIMs mais elevadas para FLC, AND e AMB (3,79 µg/mL, 2,11 µg/mL e 1 µg/mL, respectivamente) quando comparadas com dados de C. guilliermondii sensu stricto (2,70 µg/mL, 1,77 µg/mL e 0,66 µg/mL, respectivamente). Quanto aos valores de CIMs para VOR, ambas obtiveram a mesma média geométrica de 1 µg/mL. Conclusão: O sequenciamento das regiões do gene ribossomal permitiu a identificação acurada de todos os isolados testados. Utilizando a técnica de RFLP foi possível discriminar C. guilliermondii sensu stricto de C. fermentati, porém não foi possível discriminar C. carpohila de C. fermentati. Criamos um banco proteômico capaz de discriminar isolados de C. guilliermondii sensu stricto e C. fermentati. Na casuística estudada, isolados clínicos de C. fermentati apresentaram menor susceptibilidade frente aos antifúngicos FLC, AND e AMB, quando comparadas a isolados de C. guilliermondii sensu stricto.
Candida guilliermondii representa hoje um complexo de espécies emergentes, algumas delas com importância clínica, tendo sido descrita em 1912 por Castellani et al., a partir de cultivo de escarro de paciente com infecção brônquica. Atualmente é responsável por 1-25% das infecções de corrente sanguínea causadas por Candida sp. em diferentes regiões geográficas. A despeito das variações biológicas deste complexo, na vida real, estes isolados de C. guilliermondii são caracterizados como unidade taxonômica única quando identificados por métodos fenotípicos. Entretanto, a análise molecular do DNA genômico permite a diferenciação de 7 espécies distintas neste complexo: C. guilliermondii sensu stricto (Meyerozyma guilliermondii), C. fermentati (Meyerozyma carribicca), C. smithsonii, C. athensensis, C. elateridarum, C. carpophila e C. glucosophila. Até o momento, apenas três espécies do complexo foram associadas a infecções em humanos: C. guilliermondii, C. fermentati e C. carpophila. Há poucos dados sobre putativas peculiaridades biológicas e clínicas das infecções causadas pelas espécies deste complexo, sendo desconhecida sua prevalência em centros médicos no Brasil e América Latina. Objetivos: Determinar a prevalência de diferentes espécies do complexo Candida guilliermondii em episódios de candidemia sequencialmente documentados em centros médicos sentinelas, padronizar estratégia de identificação de espécies do complexo e avaliar o perfil de susceptibilidade in vitro a antifúngicos destes isolados. Material e Métodos: Um total de 150 isolados obtidos de pacientes com fungemia atendidos em 18 centros médicos do Brasil e América Latina, inicialmente identificados como pertencentes ao complexo C. guilliermondii foram submetidos a identificação por sequenciamento das regiões ITS do rDNA. Para o RFLP foi realizado uma PCR da região ITS do rDNA, e o fragmento do DNA amplificado foi submetido a uma digestão com a enzima Taq I. Em relação ao perfil proteômico destes isolados, a aquisição do perfil proteico foi realizada no sistema Bruker Daltonics com montagem da biblioteca in-house. Os testes de susceptibilidade in vitro foram realizados de acordo com documento M27-A3 e M27-S4 do CLSI, utilizando os antifúngicos: anfotericina B (AMB), fluconazol (FLC), voriconazol (VOR) e anidulafungina (AND). Resultados: Entre os 150 isolados estudados, 135 isolados foram identificados como C. guilliermondii sensu stricto, 13 isolados como C. fermentati e 2 isolados como C. carpophila. Utilizando ensaio de RFLP foi possível constatar que os isolados de C. guilliermondii sensu stricto apresentaram um perfil de bandeamento com 2 bandas (~250 e 190 pb) e C. fermentati e C. carpophila com 3 bandas (~250,190 e 150pb). Criamos um banco proteômico robusto com 5 perfis de isolados das espécies C. guilliermondii sensu stricto e C. fermentati. Em geral, nos testes de sensibilidade aos antifúngicos, os isolados de C. fermentati apresentaram médias geométricas de CIMs mais elevadas para FLC, AND e AMB (3,79 µg/mL, 2,11 µg/mL e 1 µg/mL, respectivamente) quando comparadas com dados de C. guilliermondii sensu stricto (2,70 µg/mL, 1,77 µg/mL e 0,66 µg/mL, respectivamente). Quanto aos valores de CIMs para VOR, ambas obtiveram a mesma média geométrica de 1 µg/mL. Conclusão: O sequenciamento das regiões do gene ribossomal permitiu a identificação acurada de todos os isolados testados. Utilizando a técnica de RFLP foi possível discriminar C. guilliermondii sensu stricto de C. fermentati, porém não foi possível discriminar C. carpohila de C. fermentati. Criamos um banco proteômico capaz de discriminar isolados de C. guilliermondii sensu stricto e C. fermentati. Na casuística estudada, isolados clínicos de C. fermentati apresentaram menor susceptibilidade frente aos antifúngicos FLC, AND e AMB, quando comparadas a isolados de C. guilliermondii sensu stricto.