Modulação das vias de sinalização intracelulares de células imortalizadas do túbulo proximal de rato submetidas a altas concentrações de frutose
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Data
2017-11-30
Autores
Matsumoto, Larissa Emi [UNIFESP]
Orientadores
Casarini, Dulce Elena [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
For decades, technological advances and improvement in financial conditions associated with a sedentary lifestyle and an increase in the daily caloric intake of the world population, mainly western, resulted in changes in day to day diet balance. These changes include increased consumption of industrialized foods containing fructose, such as artificially sugar-sweetened beverages, desserts and candies. Several studies have demonstrated this monosaccharide may be responsible for cardiovascular and renal diseases, as well as obesity, diabetes, hypertension, dyslipidemia and, consequently, metabolic syndrome (MS). The hypertension induced by high fructose consumption is associated with non-balance of the Renin-Angiotensin System (RAS). It acts as a endocrine system through circulation and can also act locally in several tissues such as liver, heart and kidneys. In the kidney, the proximal tubule (PT) that is the major region of sodium and water re-absorption expresses all of the RAS components. In high fructose ingestion, inflammation has been observed in this region, but it is unclear how Angiotensin II (Ang II) contributes to fructose inflammatory process, as well as which signaling pathways are involved in this process. We hypothesized that high fructose stimulation can increase Ang II concentration in immortalized rat proximal tubule cells (IRPTC), which results in activation of proinflammatory second messengers as mitogenactivated protein kinases, including extracellular-signal-regulated kinases (ERK 1 and 2), as well as changes the transepithelial electrical resistance (TEER) consequently impacting sodium and water transport, and other transductional efectors that leads to fibrosis and oxidative stress.. To verify the ERK 1 and 2 phosphorilation pattern, the cells were treated with high fructose concentrations for further Western blotting analysis (WB). To analyze changes in TEER, IRPTCs were stimulated with high concentrations of fructose, high concentrations of sodium chloride alone (NaCl) and fructose added to NaCl. In addition, changes in protein expression of water channels, aquaporins 1 (AQP1), receptors (AT1R, AT2R, Gq-GNAQ protein coupled receptors), Na+/H+ exchanger (NHE 3), fructose transporters (GLUT 2 and GLUT 5) and Ang II peptide were qualitatively analyzed by immunofluorescence in the same cells and treatments. For an evaluation of the expression of representative genes involved in G protein-coupled membrane receptor (GPCR) signaling pathways, a specific commercial PCR array was used for this pathway. Our results indicate that the group treated with high fructose enhanced phosphorilated ERK 1 and 2 expression. The TEER results showed that voltage in fructose and fructose + NaCl treated cells were significantly modulated compared to the negative (without any treatment) and positive (NaCl) control. Immunofluorescence analysis provided fructose-dependent changes in GLUT2, GLUT5, NHE3 and Ang II protein expression and AQP1 and AT1R protein translocation. PCR array data revealed significant differences in expression of several genes, that may lead to increased oxidative stress, hypertrophy and celular fibrosis. In conclusion, the renal cell response to high fructose concentrations triggers the modulation of sodium and water reabsorption, RAS activation and increase in ERK 1 and 2 phosphorylation through complex intracellular signaling cascades, contributing to the development of several pathologies.
Ao longo de décadas, avanços tecnológicos e o aumento do poder aquisitivo associados a um estilo de vida sedentário e um acréscimo na ingestão calórica diária da população mundial, principalmente ocidental, resultaram no aumento do consumo de alimentos industrializados contendo frutose, como bebidas, doces e balas artificialmente adoçados. Diversos estudos demonstram que este monossacarídeo pode ser responsável por doenças cardiovasculares e renais, além de obesidade, diabetes, hipertensão, dislipidemia e consequente síndrome metabólica (SM). A hipertensão induzida pelo alto consumo de frutose está associada com alterações no balanço do Sistema Renina-Angiotensina (SRA). Este sistema atua de maneira endócrina através da circulação e, também, pode atuar localmente em diversos tecidos como fígado, coração e rins. Nos rins, o túbulo proximal (TP) é considerado a principal região de reabsorção de sódio e água e é capaz de expressar todos os componentes do SRA. Ainda não está claro qual o papel da frutose neste processo inflamatório, assim como as vias de sinalização ativadas e sua ligação com o SRA. O objetivo do presente estudo foi investigar se o estímulo com alta concentração de frutose pode aumentar a expressão de Ang II em células imortalizadas do túbulo proximal de ratos (IRPTC), o que resulta na ativação de segundos mensageiros pró-inflamatórios, como proteíno-cinases ativadas por mitógeno (MAPK), incluindo a cinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 (ERK 1 e 2), assim como alterações na resistência e voltagem elétricas transepiteliais (TEER), que resultam em impactos no transporte de sódio e água, e outros mensageiros envolvidos no desenvolvimento da fibrose e estresse oxidativo. A fim de verificar o padrão de fosforilação da ERK 1 e 2, as células foram tratadas com altas concentrações de frutose para posterior análise por Western blotting (WB). Para análise de alterações na TEER, as células foram estimuladas com altas concentrações de frutose, altas concentrações de cloreto de sódio (NaCl) e frutose adicionada a NaCl. Foi analisado através de imunofluorescência, a expressão proteica dos canais de água, as aquaporinas 1 (AQP1), dos receptores da angiotensina II tipo 1 (AT1R) e da angiotensina II tipo 2 – (AT2R), receptores estes acoplados à proteína Gq – (GNAQ), trocadores de Na+/H+ (NHE3), transportadores de frutose (GLUT 2 e GLUT 5) e Angiotensina II (Ang II) nas células imortalizadas sob os mesmos tratamentos. Utilizamos para a avaliação da expressão dos genes representativos e envolvidos nas vias de sinalização dos receptores GPCR, o kit de PCR array comercial específico para esta via. A análise por Western blotting demonstrou que houve um aumento na fosforilação de ERK 1/2 com a adição de frutose. Os resultados de TEER mostraram que há uma modulação na resistência e voltagem das células nos grupos tratados com frutose e frutose com NaCl quando comparados aos controles negativo (sem tratamento) e positivo (NaCl). Dados referentes à imunofluorescência revelaram uma alteração proteica de GLUT2, GLUT5, NHE3 e Ang II e uma translocação de AQP1 e AT1R. Experimentos de PCR array revelaram diferenças significativas na expressão de diversos genes, que podem levar ao aumento de estresse oxidativo, hipertrofia e fibrose celular. Em conclusão, a resposta celular renal a altas concentrações de frutose desencadeiam a modulação da reabsorção de sódio e água, a ativação do SRA e o aumento da fosforilação de ERK 1 e 2 através de complexas cascatas de sinalização intracelular, contribuindo para o desenvolvimento de diversas patologias.
Ao longo de décadas, avanços tecnológicos e o aumento do poder aquisitivo associados a um estilo de vida sedentário e um acréscimo na ingestão calórica diária da população mundial, principalmente ocidental, resultaram no aumento do consumo de alimentos industrializados contendo frutose, como bebidas, doces e balas artificialmente adoçados. Diversos estudos demonstram que este monossacarídeo pode ser responsável por doenças cardiovasculares e renais, além de obesidade, diabetes, hipertensão, dislipidemia e consequente síndrome metabólica (SM). A hipertensão induzida pelo alto consumo de frutose está associada com alterações no balanço do Sistema Renina-Angiotensina (SRA). Este sistema atua de maneira endócrina através da circulação e, também, pode atuar localmente em diversos tecidos como fígado, coração e rins. Nos rins, o túbulo proximal (TP) é considerado a principal região de reabsorção de sódio e água e é capaz de expressar todos os componentes do SRA. Ainda não está claro qual o papel da frutose neste processo inflamatório, assim como as vias de sinalização ativadas e sua ligação com o SRA. O objetivo do presente estudo foi investigar se o estímulo com alta concentração de frutose pode aumentar a expressão de Ang II em células imortalizadas do túbulo proximal de ratos (IRPTC), o que resulta na ativação de segundos mensageiros pró-inflamatórios, como proteíno-cinases ativadas por mitógeno (MAPK), incluindo a cinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 (ERK 1 e 2), assim como alterações na resistência e voltagem elétricas transepiteliais (TEER), que resultam em impactos no transporte de sódio e água, e outros mensageiros envolvidos no desenvolvimento da fibrose e estresse oxidativo. A fim de verificar o padrão de fosforilação da ERK 1 e 2, as células foram tratadas com altas concentrações de frutose para posterior análise por Western blotting (WB). Para análise de alterações na TEER, as células foram estimuladas com altas concentrações de frutose, altas concentrações de cloreto de sódio (NaCl) e frutose adicionada a NaCl. Foi analisado através de imunofluorescência, a expressão proteica dos canais de água, as aquaporinas 1 (AQP1), dos receptores da angiotensina II tipo 1 (AT1R) e da angiotensina II tipo 2 – (AT2R), receptores estes acoplados à proteína Gq – (GNAQ), trocadores de Na+/H+ (NHE3), transportadores de frutose (GLUT 2 e GLUT 5) e Angiotensina II (Ang II) nas células imortalizadas sob os mesmos tratamentos. Utilizamos para a avaliação da expressão dos genes representativos e envolvidos nas vias de sinalização dos receptores GPCR, o kit de PCR array comercial específico para esta via. A análise por Western blotting demonstrou que houve um aumento na fosforilação de ERK 1/2 com a adição de frutose. Os resultados de TEER mostraram que há uma modulação na resistência e voltagem das células nos grupos tratados com frutose e frutose com NaCl quando comparados aos controles negativo (sem tratamento) e positivo (NaCl). Dados referentes à imunofluorescência revelaram uma alteração proteica de GLUT2, GLUT5, NHE3 e Ang II e uma translocação de AQP1 e AT1R. Experimentos de PCR array revelaram diferenças significativas na expressão de diversos genes, que podem levar ao aumento de estresse oxidativo, hipertrofia e fibrose celular. Em conclusão, a resposta celular renal a altas concentrações de frutose desencadeiam a modulação da reabsorção de sódio e água, a ativação do SRA e o aumento da fosforilação de ERK 1 e 2 através de complexas cascatas de sinalização intracelular, contribuindo para o desenvolvimento de diversas patologias.