High resolution melting versus sequenciamento genético de nova geração na detecção de mutação do gene KRAS em câncer colorretal
Data
2017-05-30
Autores
Miranda, Raelson Rodrigues 
Orientadores
Forones, Nora Manoukian
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Introduction: Frequency of KRAS gene mutations in colorectal cancer is around 34% and confers poor prognosis. The most frequency are on exon 2, 3 and 4. The knowledge about KRAS profile plays crucial role in the management of this disease, because the use of MABs like cetuximab and panitumumab are recommended exclusively for KRAS wild-type tumors. In other words, it has important predictive value. PCR-High-Resolution melting (HRM) analysis is a novel technology able to detect mutations with high sensitivity through of variations in melting temperature of DNA with low cost than sequencing methods. Therefore, could be a good tool for screening of KRAS mutations. Objective: Comparing capacity of HRM to detect exons 2, 3 and 4 KRAS mutations with Next Generation Sequencing. Methods: We performed PCR-HRM runs for 47 patients with confirmed colorectal adenocarcinoma in StepOne plus Real-time PCR (Thermo-Fisher/Life Technology©) and compared the melting temperature and HRM curve between mutated and wild-type groups. We used the Illumina HiSeq platform® as reference methods for the Next Generation Sequencing. The statistical analysis was performed through SPSS software v20.1. Results: For exon 2, the melt curves were different between mutant and wild-type groups. The mean of melting temperature was 78.13 ºC for wild-type and 77.87 ºC for mutant profile (p= 0.001; CI 95%: 0,11-0,41; T-test). Sensitivity was 93.8%, specificity 96.6%, PPV 92.2%, NPV 98.51%, accuracy 91.5% and false positive and negative rates 3,4% for PCR-HRM. In terms of exons 3 and 4, melt curve were not different. Conclusions: In this study, the high resolution melting curve profile proved be a good test for screening of exon 2 KRAS mutations in colorectal cancer with high sensitivity and specificity. However, for exons 3 and 4, HRM was not able to detect mutations.
Introdução: As mutações do gene KRAS no câncer colorretal são da ordem de 34%, conferindo pior prognóstico. As mais frequentes estão nos éxons 2, 3 e 4 respectivamente. O conhecimento acerca do perfil mutacional de KRAS têm papel crucial no manejo dessa doença, uma vez que anticorpos monoclonais como cetuximabe e panitumumabe são indicados apenas em tumores KRAS selvagem. Em outras palavras, tem importante valor preditivo. PCR-High Resolution Melting é uma nova tecnologia capaz de detectar mutações com alta sensibilidade através de variações da temperatura de melting do DNA, com um custo menor em relação aos métodos de sequenciamento. Objetivo: avaliar a capacidade de detecção de mutação no gene KRAS por High Resolution Melting - HRM nos éxons 2, 3 e 4 e comparar com sequenciamento de nova geração. Métodos: Realizamos análise de HRM em 47 amostras de pacientes portadores de adenocarcinoma de cólon utilizando StepOne plus Real-time PCR e Illumina HiSeq como plataforma de referência para sequenciamento de nova geração. A análise estatística foi feita pelo software SPSS v20.1. Resultados: Em relação ao éxon 2, as curvas de melting foram diferentes entre os grupos selvagem e mutados. A média da temperatura de melting (Tm) foi de 78,13 ºC para o grupo selvagem e 77,87 ºC para o grupo mutado (p= 0.001; IC 95%: 0,11-0,41; Teste T). A sensibilidade foi de 93,8% e a especificidade de 96,6%, com valor preditivo positivo de 92,2%, valor preditivo negativo 98,5%, acurácia 91,5% e taxas de falso positivo e negativo de 3,4% para HRM. Em relação aos éxons 3 e 4, as curvas de melt entre mutados e selvagens não se diferenciaram. Conclusões: Neste estudo, a técnica de HRM mostrou ser uma boa alternativa de rastreio de mutações no éxon 2 de KRAS em câncer colorretal com alta sensibilidade e especificidade. Contudo, para os éxons 3 e 4, HRM não conseguiu diferenciar entre mutados e selvagens.
Introdução: As mutações do gene KRAS no câncer colorretal são da ordem de 34%, conferindo pior prognóstico. As mais frequentes estão nos éxons 2, 3 e 4 respectivamente. O conhecimento acerca do perfil mutacional de KRAS têm papel crucial no manejo dessa doença, uma vez que anticorpos monoclonais como cetuximabe e panitumumabe são indicados apenas em tumores KRAS selvagem. Em outras palavras, tem importante valor preditivo. PCR-High Resolution Melting é uma nova tecnologia capaz de detectar mutações com alta sensibilidade através de variações da temperatura de melting do DNA, com um custo menor em relação aos métodos de sequenciamento. Objetivo: avaliar a capacidade de detecção de mutação no gene KRAS por High Resolution Melting - HRM nos éxons 2, 3 e 4 e comparar com sequenciamento de nova geração. Métodos: Realizamos análise de HRM em 47 amostras de pacientes portadores de adenocarcinoma de cólon utilizando StepOne plus Real-time PCR e Illumina HiSeq como plataforma de referência para sequenciamento de nova geração. A análise estatística foi feita pelo software SPSS v20.1. Resultados: Em relação ao éxon 2, as curvas de melting foram diferentes entre os grupos selvagem e mutados. A média da temperatura de melting (Tm) foi de 78,13 ºC para o grupo selvagem e 77,87 ºC para o grupo mutado (p= 0.001; IC 95%: 0,11-0,41; Teste T). A sensibilidade foi de 93,8% e a especificidade de 96,6%, com valor preditivo positivo de 92,2%, valor preditivo negativo 98,5%, acurácia 91,5% e taxas de falso positivo e negativo de 3,4% para HRM. Em relação aos éxons 3 e 4, as curvas de melt entre mutados e selvagens não se diferenciaram. Conclusões: Neste estudo, a técnica de HRM mostrou ser uma boa alternativa de rastreio de mutações no éxon 2 de KRAS em câncer colorretal com alta sensibilidade e especificidade. Contudo, para os éxons 3 e 4, HRM não conseguiu diferenciar entre mutados e selvagens.