Atividade citotóxica de secretoma de Aspergillus fumigatus em células de carcinoma de pulmão
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Data
2017-12-21
Autores
Sousa, Ana Cristina Peres de [UNIFESP]
Orientadores
Colombo, Arnaldo Lopes [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Introduction Aspergillus fumigatus is a fungi with high adaptive capacity and virulence factors that favors its establishment and colonization in the human host. Species of Aspergillus genus are recognized for its high capacity for production of secondary metabolites, extensively documented in the literature. Among these metabolites, there are some isolated molecules used as drugs, for the cholesterol control (lovastatin) and even in the combat of other fungi (echinocandins). Several molecules produced by A. fumigatus have already been tested on human cells/ in vitro cells searching for bioactive molecules. Gliotoxin is one of the most studied A. fumigatus molecule, that inhibits the host immune response, negatively modulating angiogenesis and inducing many cell lines to apoptosis. In view of the great diversity of molecules produced by A. fumigatus, the interest to explore its biological potential focusing on cytotoxic activity in lung carcinoma cells, the target organ of infection by this agent in the human host is justified. Objective To obtain the secretome from clinical isolates of A. fumigatus and investigate the potential cytotoxic activity of its fractions on A549 cells. Methodology Six clinical isolates of A. fumigatus from patients with pulmonary aspergillosis were identified at species level using a polyphasic approach, including ITS region, Calmodulin and β-tubulin genes sequencing. After standardization of the optimal conditions to obtain secretomes samples with reproducible composition (same profile when evaluated by LC-MS), we started the screening for biological activity of these molecules in A549 cells through cytotoxicity assays in which measurement of metabolic activity was done by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide salt (MTT) assay. Once that the most active secretome was identified, it was submitted to sequential fractionations through preparative Liquid Chromatography (LC), with the aim of purifying the fraction that was responsible for the cytotoxic effect found. Finally, annexin V cell death assays were performed to analyse the cell death pattern induced by the active subfraction. Result The standardization of A549 cell culture and secretome extraction in MMBA culture medium of reproducible composition was successfully achieved. Regarding the biological activity of secretome samples from 6 A. fumigatus isolates, the isolate 934 was presented the highest cytotoxic effect in MTT assays. From this finding, 2 sequential secretome fractionations were performed and it was possible to isolate a subfraction identified as Z5, which presented consistent cytotoxic activity, reducing 90% of cell viability when compared to control (p <0.02). The annexin V assay has led to the conclusion that this subfraction mainly induces apoptosis in A549 cells. New assays are needed to characterize the A. fumigatus secretome subfraction that presented cytotoxic activity as well as to confirm its potential antitumor activity.
Introdução Aspergillus fumigatus é um fungo com elevada capacidade adaptativa e fatores de virulência que favorecem sua instalação e colonização no hospedeiro humano. Espécies do gênero Aspergillus são reconhecidas pela alta capacidade de produção de metabólitos secundários, extensivamente documentada na literatura. Dentre esses metabólitos, algumas moléculas isoladas são utilizadas como fármacos, ajudando no controle do colesterol (lovastatina) e até no combate a outros fungos (equinocandinas). Várias moléculas produzidas por A. fumigatus já foram testadas contra células na busca de moléculas bioativas. Dentre essas moléculas, a gliotoxina é uma das mais exploradas, inibindo a resposta imunológica do hospedeiro, modulando negativamente a angiogênese e induzindo várias linhagens celulares a apoptose. Diante da grande diversidade de moléculas produzidas por A. fumigatus, está justificado o interesse em explorar seu potencial biológico com foco na identificação de substâncias com atividade citotóxica em células de carcinoma de pulmão, órgão alvo de infecção por este agente no hospedeiro humano. Objetivo Obter secretoma de isolados clínicos de A. fumigatus e investigar a potencial atividade de citotóxica de suas frações sobre células A549. Metodologia Seis isolados clínicos de A. fumigatus provenientes de pacientes com aspergilose pulmonar foram identificados em nível de espécie por abordagem polifásica, incluindo sequenciamento da região ITS e dos genes Calmodulina e β-tubulina. Após padronização de condições ótimas para obterse amostras de secretomas de composição reprodutível (mesmo perfil quando avaliado por LC-MS), foi iniciada a triagem de atividade biológica destas moléculas através de ensaios de citotoxicidade em células A549, com mensuração de atividade metabólica através do ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium (MTT). Uma vez identificado o secretoma mais ativo, este foi submetido a fracionamentos sequenciais, através de Cromatografia Líquida (LC) preparativa, com o objetivo de purificar a fração responsável pelo efeito citotóxico encontrado. Ao final, planejou-se a realização de ensaios de morte celular com anexina V para analisar o padrão de morte celular induzido pela subfração ativa. Resultado Obteve-se êxito na padronização do cultivo de células A549 e da extração de secretoma em meio de cultura MMBA, cuja composição mostrou-se reprodutível em diferentes experimentos (LC-MS). Investigando a atividade biológica das amostras de secretoma de 6 isolados de A. fumigatus, identificou-se o isolado 934 como aquele com maior efeito citotóxico nos ensaios de MTT. A partir deste achado, foram realizados 2 fracionamentos sequenciais do secretoma, sendo possível isolar a subfração identificada como Z5 que apresentou atividade citotóxica consistente, reduzindo em 90% a viabilidade celular quando comparado ao controle (p < 0,02). O ensaio de anexina V permitiu concluir que essa subfração induz, majoritariamente, a apoptose em células A549. Novos ensaios são necessários para caracterizar a subfração de secretoma de A fumigatus que apresentou atividade citotóxica, bem como para confirmar sua potencial atividade antitumoral.
Introdução Aspergillus fumigatus é um fungo com elevada capacidade adaptativa e fatores de virulência que favorecem sua instalação e colonização no hospedeiro humano. Espécies do gênero Aspergillus são reconhecidas pela alta capacidade de produção de metabólitos secundários, extensivamente documentada na literatura. Dentre esses metabólitos, algumas moléculas isoladas são utilizadas como fármacos, ajudando no controle do colesterol (lovastatina) e até no combate a outros fungos (equinocandinas). Várias moléculas produzidas por A. fumigatus já foram testadas contra células na busca de moléculas bioativas. Dentre essas moléculas, a gliotoxina é uma das mais exploradas, inibindo a resposta imunológica do hospedeiro, modulando negativamente a angiogênese e induzindo várias linhagens celulares a apoptose. Diante da grande diversidade de moléculas produzidas por A. fumigatus, está justificado o interesse em explorar seu potencial biológico com foco na identificação de substâncias com atividade citotóxica em células de carcinoma de pulmão, órgão alvo de infecção por este agente no hospedeiro humano. Objetivo Obter secretoma de isolados clínicos de A. fumigatus e investigar a potencial atividade de citotóxica de suas frações sobre células A549. Metodologia Seis isolados clínicos de A. fumigatus provenientes de pacientes com aspergilose pulmonar foram identificados em nível de espécie por abordagem polifásica, incluindo sequenciamento da região ITS e dos genes Calmodulina e β-tubulina. Após padronização de condições ótimas para obterse amostras de secretomas de composição reprodutível (mesmo perfil quando avaliado por LC-MS), foi iniciada a triagem de atividade biológica destas moléculas através de ensaios de citotoxicidade em células A549, com mensuração de atividade metabólica através do ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium (MTT). Uma vez identificado o secretoma mais ativo, este foi submetido a fracionamentos sequenciais, através de Cromatografia Líquida (LC) preparativa, com o objetivo de purificar a fração responsável pelo efeito citotóxico encontrado. Ao final, planejou-se a realização de ensaios de morte celular com anexina V para analisar o padrão de morte celular induzido pela subfração ativa. Resultado Obteve-se êxito na padronização do cultivo de células A549 e da extração de secretoma em meio de cultura MMBA, cuja composição mostrou-se reprodutível em diferentes experimentos (LC-MS). Investigando a atividade biológica das amostras de secretoma de 6 isolados de A. fumigatus, identificou-se o isolado 934 como aquele com maior efeito citotóxico nos ensaios de MTT. A partir deste achado, foram realizados 2 fracionamentos sequenciais do secretoma, sendo possível isolar a subfração identificada como Z5 que apresentou atividade citotóxica consistente, reduzindo em 90% a viabilidade celular quando comparado ao controle (p < 0,02). O ensaio de anexina V permitiu concluir que essa subfração induz, majoritariamente, a apoptose em células A549. Novos ensaios são necessários para caracterizar a subfração de secretoma de A fumigatus que apresentou atividade citotóxica, bem como para confirmar sua potencial atividade antitumoral.