Caracterização E Vias De Sinalização Intracelular Dos Receptores Estrogênicos Em Células De Câncer Prostático Independentes De Andrógenos Du-145
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Date
2017-09-28
Authors
Souza, Deborah Simao De [UNIFESP]
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Porto, Catarina Segreti [UNIFESP]
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Dissertação de mestrado
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Abstract
Andrógenos, estrógenos e as interações parácrinas entre o estroma e o epitélio estão envolvidos no desenvolvimento do câncer prostático. O câncer prostático inicialmente responde bem à terapia de ablação androgênica, mas em muitos casos o tumor progride para um fenótipo independente de andrógeno ou também denominado resistente à castração (CRPC, castration resistant prostate cancer). Os estrógenos atuando nos clássicos receptores estrogênicos ESR1 (ERα) e ESR2 (ERβ) poderiam ter uma função importante neste mecanismo. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar a expressão, a localização e a sinalização intracelular dos receptores estrogênicos em linhagem celular de câncer prostático independente de andrógenos DU-145 (células de metástase cerebral de carcinoma prostático), usada in vitro como um modelo de CRPC. Células epiteliais de próstata (PNT1A), obtida de um homem pós-puberdade, foram usadas como controle em alguns experimentos. Além disso, foi avaliada a contribuição de ESR1 e ESR2 na ativação das vias de sinalização intracelular ERK1/2 (extracelular signal-regulated protein kinases) e da serino/treonina quinase AKT. Foi mostrado que: 1. Os clássicos receptores estrogênicos (ESR1 e ESR2) estão localizados próximo à membrana plasmática e no citoplasma (compartimento extranuclear) das células DU-145. Estes resultados foram confirmados por ensaios de Western blot. A localização predominantemente extracelular de ambos os receptores nas células DU-145 difere da localização nuclear observada na maioria das células-alvo do estrógeno e sugere que estes receptores possam desempenhar uma função na sinalização rápida dos estrógenos nas células de câncer prostático independentes de andrógenos DU-145. 2. Na presença do inibidor de CRM1 (exportina1, proteína que transporta macromoléculas do núcleo para o citoplasma) leptomicina B, imunomarcações para o ESR1 e o ESR2 estão presentes no núcleo das células DU-145, sugerindo o envolvimento da CRM1 na localização preferencialmente extranuclear dos ERs nestas células. 3. O tratamento das células DU-145 com E2 levou à rápida fosforilação da ERK1/2 aos 5 minutos. Este efeito foi parcialmente bloqueado pelos antagonistas seletivos do ESR1 (MPP) ou do ESR2 (PHTPP). Os agonistas seletivos do ESR1 (PPT) e do ESR2 (DPN) também levaram ao aumento da fosforilação da ERK1/2. Estes efeitos foram bloqueados pelos respectivos antagonistas seletivos. A ativação da ERK1/2 pelo E2 foi bloqueada totalmente pela pré-incubação simultânea com os antagonistas seletivos do ESR1 (MPP) e do ESR2 (PHTPP). Estes resultados, em conjunto, sugerem que a heterodimerização destes receptores possa ser importante para a ativação das vias de sinalização rápida, como por exemplo, a fosforilação da ERK1/2. 4. Nas células DU-145, a expressão da AKT total foi detectada, mas não a da AKT fosforilada. O tratamento com E2 não alterou a expressão da AKT nem induziu fosforilação da AKT nestas células. 5. A isoforma ESR1-36 e o receptor acoplado à proteína G (GPER) estão presentes próximos à membrana plasmática e no citoplasma das células PNT1A e DU-145, sugerindo que alguma via de sinalização rápida poderia ser ativada por estes receptores. Em resumo, neste estudo foi detectada a presença dos receptores estrogênicos ESR1 e ESR2, preferencialmente próximo à membrana plasmática e no citoplasma (compartimento extranuclear) das células DU-145. A exportina CRM1 está envolvida na translocação destes receptores do núcleo para o citoplasma e para a superfície celular. A localização preferencialmente extranuclear destes receptores sugere que vias de sinalizações rápidas, mediadas pelos estrógenos, estão preferencialmente ativas nas células DU-145. De fato, a ativação de ESR1 e ESR2 leva à fosforilação da ERK1/2, mas não da AKT nestas células. Além disso, detectamos também a presença da isoforma ESR1-36 e do GPER, sendo o primeiro estudo a reportar a presença do ESR1-36 em linhagens de células prostáticas normais PNT1A e cancerígenas DU-145. A presença destes receptores evidencia o processo multifatorial da sinalização estrogênica nestas células. O entendimento da regulação, de outras vias de sinalização e das funções destes receptores, pode levar à melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no câncer prostático resistente à castração.
Andrógenos, estrógenos e as interações parácrinas entre o estroma e o epitélio estão envolvidos no desenvolvimento do câncer prostático. O câncer prostático inicialmente responde bem à terapia de ablação androgênica, mas em muitos casos o tumor progride para um fenótipo independente de andrógeno ou também denominado resistente à castração (CRPC, castration resistant prostate cancer). Os estrógenos atuando nos clássicos receptores estrogênicos ESR1 (ERα) e ESR2 (ERβ) poderiam ter uma função importante neste mecanismo. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar a expressão, a localização e a sinalização intracelular dos receptores estrogênicos em linhagem celular de câncer prostático independente de andrógenos DU-145 (células de metástase cerebral de carcinoma prostático), usada in vitro como um modelo de CRPC. Células epiteliais de próstata (PNT1A), obtida de um homem pós-puberdade, foram usadas como controle em alguns experimentos. Além disso, foi avaliada a contribuição de ESR1 e ESR2 na ativação das vias de sinalização intracelular ERK1/2 (extracelular signal-regulated protein kinases) e da serino/treonina quinase AKT. Foi mostrado que: 1. Os clássicos receptores estrogênicos (ESR1 e ESR2) estão localizados próximo à membrana plasmática e no citoplasma (compartimento extranuclear) das células DU-145. Estes resultados foram confirmados por ensaios de Western blot. A localização predominantemente extracelular de ambos os receptores nas células DU-145 difere da localização nuclear observada na maioria das células-alvo do estrógeno e sugere que estes receptores possam desempenhar uma função na sinalização rápida dos estrógenos nas células de câncer prostático independentes de andrógenos DU-145. 2. Na presença do inibidor de CRM1 (exportina1, proteína que transporta macromoléculas do núcleo para o citoplasma) leptomicina B, imunomarcações para o ESR1 e o ESR2 estão presentes no núcleo das células DU-145, sugerindo o envolvimento da CRM1 na localização preferencialmente extranuclear dos ERs nestas células. 3. O tratamento das células DU-145 com E2 levou à rápida fosforilação da ERK1/2 aos 5 minutos. Este efeito foi parcialmente bloqueado pelos antagonistas seletivos do ESR1 (MPP) ou do ESR2 (PHTPP). Os agonistas seletivos do ESR1 (PPT) e do ESR2 (DPN) também levaram ao aumento da fosforilação da ERK1/2. Estes efeitos foram bloqueados pelos respectivos antagonistas seletivos. A ativação da ERK1/2 pelo E2 foi bloqueada totalmente pela pré-incubação simultânea com os antagonistas seletivos do ESR1 (MPP) e do ESR2 (PHTPP). Estes resultados, em conjunto, sugerem que a heterodimerização destes receptores possa ser importante para a ativação das vias de sinalização rápida, como por exemplo, a fosforilação da ERK1/2. 4. Nas células DU-145, a expressão da AKT total foi detectada, mas não a da AKT fosforilada. O tratamento com E2 não alterou a expressão da AKT nem induziu fosforilação da AKT nestas células. 5. A isoforma ESR1-36 e o receptor acoplado à proteína G (GPER) estão presentes próximos à membrana plasmática e no citoplasma das células PNT1A e DU-145, sugerindo que alguma via de sinalização rápida poderia ser ativada por estes receptores. Em resumo, neste estudo foi detectada a presença dos receptores estrogênicos ESR1 e ESR2, preferencialmente próximo à membrana plasmática e no citoplasma (compartimento extranuclear) das células DU-145. A exportina CRM1 está envolvida na translocação destes receptores do núcleo para o citoplasma e para a superfície celular. A localização preferencialmente extranuclear destes receptores sugere que vias de sinalizações rápidas, mediadas pelos estrógenos, estão preferencialmente ativas nas células DU-145. De fato, a ativação de ESR1 e ESR2 leva à fosforilação da ERK1/2, mas não da AKT nestas células. Além disso, detectamos também a presença da isoforma ESR1-36 e do GPER, sendo o primeiro estudo a reportar a presença do ESR1-36 em linhagens de células prostáticas normais PNT1A e cancerígenas DU-145. A presença destes receptores evidencia o processo multifatorial da sinalização estrogênica nestas células. O entendimento da regulação, de outras vias de sinalização e das funções destes receptores, pode levar à melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no câncer prostático resistente à castração.
Andrógenos, estrógenos e as interações parácrinas entre o estroma e o epitélio estão envolvidos no desenvolvimento do câncer prostático. O câncer prostático inicialmente responde bem à terapia de ablação androgênica, mas em muitos casos o tumor progride para um fenótipo independente de andrógeno ou também denominado resistente à castração (CRPC, castration resistant prostate cancer). Os estrógenos atuando nos clássicos receptores estrogênicos ESR1 (ERα) e ESR2 (ERβ) poderiam ter uma função importante neste mecanismo. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar a expressão, a localização e a sinalização intracelular dos receptores estrogênicos em linhagem celular de câncer prostático independente de andrógenos DU-145 (células de metástase cerebral de carcinoma prostático), usada in vitro como um modelo de CRPC. Células epiteliais de próstata (PNT1A), obtida de um homem pós-puberdade, foram usadas como controle em alguns experimentos. Além disso, foi avaliada a contribuição de ESR1 e ESR2 na ativação das vias de sinalização intracelular ERK1/2 (extracelular signal-regulated protein kinases) e da serino/treonina quinase AKT. Foi mostrado que: 1. Os clássicos receptores estrogênicos (ESR1 e ESR2) estão localizados próximo à membrana plasmática e no citoplasma (compartimento extranuclear) das células DU-145. Estes resultados foram confirmados por ensaios de Western blot. A localização predominantemente extracelular de ambos os receptores nas células DU-145 difere da localização nuclear observada na maioria das células-alvo do estrógeno e sugere que estes receptores possam desempenhar uma função na sinalização rápida dos estrógenos nas células de câncer prostático independentes de andrógenos DU-145. 2. Na presença do inibidor de CRM1 (exportina1, proteína que transporta macromoléculas do núcleo para o citoplasma) leptomicina B, imunomarcações para o ESR1 e o ESR2 estão presentes no núcleo das células DU-145, sugerindo o envolvimento da CRM1 na localização preferencialmente extranuclear dos ERs nestas células. 3. O tratamento das células DU-145 com E2 levou à rápida fosforilação da ERK1/2 aos 5 minutos. Este efeito foi parcialmente bloqueado pelos antagonistas seletivos do ESR1 (MPP) ou do ESR2 (PHTPP). Os agonistas seletivos do ESR1 (PPT) e do ESR2 (DPN) também levaram ao aumento da fosforilação da ERK1/2. Estes efeitos foram bloqueados pelos respectivos antagonistas seletivos. A ativação da ERK1/2 pelo E2 foi bloqueada totalmente pela pré-incubação simultânea com os antagonistas seletivos do ESR1 (MPP) e do ESR2 (PHTPP). Estes resultados, em conjunto, sugerem que a heterodimerização destes receptores possa ser importante para a ativação das vias de sinalização rápida, como por exemplo, a fosforilação da ERK1/2. 4. Nas células DU-145, a expressão da AKT total foi detectada, mas não a da AKT fosforilada. O tratamento com E2 não alterou a expressão da AKT nem induziu fosforilação da AKT nestas células. 5. A isoforma ESR1-36 e o receptor acoplado à proteína G (GPER) estão presentes próximos à membrana plasmática e no citoplasma das células PNT1A e DU-145, sugerindo que alguma via de sinalização rápida poderia ser ativada por estes receptores. Em resumo, neste estudo foi detectada a presença dos receptores estrogênicos ESR1 e ESR2, preferencialmente próximo à membrana plasmática e no citoplasma (compartimento extranuclear) das células DU-145. A exportina CRM1 está envolvida na translocação destes receptores do núcleo para o citoplasma e para a superfície celular. A localização preferencialmente extranuclear destes receptores sugere que vias de sinalizações rápidas, mediadas pelos estrógenos, estão preferencialmente ativas nas células DU-145. De fato, a ativação de ESR1 e ESR2 leva à fosforilação da ERK1/2, mas não da AKT nestas células. Além disso, detectamos também a presença da isoforma ESR1-36 e do GPER, sendo o primeiro estudo a reportar a presença do ESR1-36 em linhagens de células prostáticas normais PNT1A e cancerígenas DU-145. A presença destes receptores evidencia o processo multifatorial da sinalização estrogênica nestas células. O entendimento da regulação, de outras vias de sinalização e das funções destes receptores, pode levar à melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no câncer prostático resistente à castração.