Celulase e álcool desidrogenase imobilizadas em filmes de Langmuir -Blodgett para identificação de celulose e etanol no nível molecular

Abstract

In this study, we investigated at the molecular level the incorporation of cellulase and alcohol dehydrogenase (ADH) in Langmuir and Langmuir-Blodgett (LB) films of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC). The mixed DPPC-enzyme films were then investigated upon contact with cellulose and ethanol. The changes at the molecular level in the properties of the films were analyzed by optical and tensiometric techniques. We aim to obtain information on the production of ethanol in a more efficient manner. The first evidence that enzymes adsorbed at the films in the lipid-water interface was through adsorption kinetic curves, wherein upon insertion of the enzyme in the aqueous subphase for monolayers of DPPC, an increase in the surface pressure values for the phospholipid matrix was observed. The second evidence was the analysis of the surface pressure-area isotherms, which showed that the presence of the enzymes caused the expansion of the lipid monolayer to higher areas. The third evidence was observed with polarization-modulated infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS), studied in Langmuir films, which revealed bands in the regions between 1500 cm-1 and 1800 cm-1, related to protein groups, namely amide II ( CN and NH bendings) and amide I (C = O stretch). In the sequence, the films were transferred to solid matrices as LB films. The PM-IRRAS analysis confirmed the successful transfer of enzyme and phospholipids. The molecular interaction between the mixed LB film (DDPC / ADH / cellulase) and cellulose was observed through PM-IRRAS since in the regions between 1500 cm-1 and 3500 cm-1, changes were observed revealing alterations in the secondary structure of the protein, related to beta-sheet, alpha-helix, beta-turn, and unordered structures. Also for the regions between 2800 cm-1 and 3500 cm-1, the symmetric and asymmetric stretches for CH in CH2 CH3 groups, as well as the stretching of amines (NH2) and OH groups could be investigated. All these factors indicate the sensitivity of the enzymes when placed in contact with cellulose dissolved in ionic liquid.

Este trabalho constitui na imobilização das enzimas celulase e álcool desidrogenase (ADH) em filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett (LB) de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) visando obter por meio dos filmes informações, em nível molecular, para o aumento da eficiência da produção de etanol celulósico. A primeira evidência de que as enzimas adsorveram aos filmes lipídicos na interface-água foi obtida por meio da análise da curva de cinética de adsorção, na qual após inserção da enzima sob monocamadas de DPPC, observou-se a elevação da pressão superficial da matriz fosfolipidíca. A segunda evidência foi através da obtenção de isotermas de pressão superficial - área, nas quais se observou que a presença das enzimas provoca a expansão da monocamada lipídica para áreas mais elevadas. A terceira evidência foi por espectroscopia de absorção-reflexão no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS), à qual, quando, estudada nos filmes de Langmuir, mostrou nas regiões entre 1500 cm-1 e 1800 cm-1 bandas protéicas, relativas à vibração amida II (dobramentos angulares C-N e N-H), e à vibração amida I (estiramento C=O). Posteriormente os filmes foram transferidos para matrizes sólidas como filmes LB. A análise por PM-IRRAS nos filmes transferidos comprovaram a transferência com sucesso de enzima e fosfolipídios. A interação molecular entre o filme LB misto (DDPC/ADH/celulase) e a celulose foi evidenciada por meio da PM-IRRAS nas regiões entre 1500 cm-1 e 3500 cm-1, onde se observaram mudanças em função do tempo nas regiões de 1500 cm-1 e 1800 cm-1 na estrutura secundária nas conformações beta-folha, alfa-hélice, volta-beta, e sem ordem definida das enzimas. Também se observou nas regiões entre 2800 cm-1 e 3500 cm-1 a presença de estiramento simétrico e assimétrico C-H de grupos CH2 e CH3, assim como o estiramento de aminas (NH2) e grupos OH. Todos esses fatores indicam a sensibilidade das enzimas quando colocadas em contato com a celulose dissolvida em líquido iônico.