Estudo molecular e funcional de genes identificados por sequenciamento paralelo em larga escala numa coorte de pacientes com hipotiroidismo congênito por disgenesias tiroidianas
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Data
2016-11-30
Autores
Kizys, Marina Malta Letro [UNIFESP]
Orientadores
Maciel, Rui Monteiro de Barros [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Congenital hypothyroidism (CH) is one of the most common endocrine disorder among newborns, with an incidence of CH is 1/1500-4000. The main cause is developmental defects on thyroid, collectively known as thyroid dysgenesis (TD). It is believed that TD results from the impaired specification, proliferation, or survival of thyroid precursor cells. Thyroid development is under control of a combined expression of a set of transcription factors such as NKX2-1, FOXE1, PAX8, and HHEX. However, just the minority of CH patients have mutations in these transcription factors. New genes derived from animal models related to the thyroid gland development have been described. So, we expanded the study of these genes in patients diagnosed with TD. In this first step, we performed the molecular screening by Sanger sequencing. Secondly, we proceeded with the molecular study through whole exome sequencing (WES) searching for new causative CH genes. In this way, we developed a pipeline of bioinformatics to both particularized and global gene analysis. Applying this pipeline, we identified some genes possibly associated with the phenotypes of the different forms of TD. We initially screened two candidate genes, dual oxidase 2 (DUOX2) and Coiled-coil domain-containing protein 114 (CCDC114) in additional patients. Besides that, their respective mutants were functionally studied in vitro and in vivo (zebrafish). Using WES and Sanger, we identified variations in CCDC114 gene in father and his son, and also in 5 of 6 sporadic patients with hemiagenesis. Functional in silico analysis suggested that 3 of 6 variations were deleterious by at least two different prediction bioinformatics program. Through in vivo functional analysis, we conducted experiments with increasing dose of morpholino experiments in zebrafish embryos that showed a phenotype of thyroid and cardiac positioning randomly altered, not being possible to correlate the deleterious variants in CCDC114 with loss-of-function of its ortholog in zebrafish. So, despite the absence of a particular thyroid phenotype in zebrafish, we observed an association of CCDC114 mutations with hemiagenesis in humans. Using the same approach, we identified 15 variations in the DUOX2 gene in patients with ectopia, being seven new ones: G201E, L264CfsX57, P609S, M650T, E810X, M822V, and E1017G. All children carrying DUOX2 mutations segregated with CH, which was confirmed by high thyroid-stimulating hormone (TSH) levels at neonatal screening, or at postnatal confirmatory diagnosis. The thyroid scintigraphy confirmed ectopia in all affected. These mutations are heterozygous compounds with functional polymorphic variants previously related to transient or permanent hypothyroidism. We verified, in vitro, that 3 of 7 abolished the translocation of the DUOX2/DUOXA2 complex to the cell membrane and impaired the DUOX2 and thyroperoxidase necessary for the thyroid hormone synthesis. Our data reinforce the utility of the WES approach to cases with complex etiopathogenesis. Part of genes appointed by WES were unexpected findings, based on their primary function of these genes already reported in the literature, as DUOX2, in which, besides its established role in hormonogenesis, it seems to be involved in thyroid ontogenesis.
O hipotiroidismo congênito (HC) é uma das doenças endócrinas mais comuns entre recém-nascidos, com incidência de 1:1500-4000. O HC é causado, principalmente, por malformações embriológicas da tiroide, conhecidas como disgenesias tiroidianas (DTs). Acredita-se que as DTs são originadas a partir de alterações de especificação, proliferação e sobrevivência das células precursoras tiroidianas. Sabe-se que a embriogênese tiroidiana é controlada por diversos fatores de transcrição, entre esses NKX2-1, FOXE1, PAX8 e HHEX. Entretanto, apenas uma minoria dos pacientes com HC apresenta mutações nestes fatores de transcrição. Novos genes derivados de modelos animais relacionados ao desenvolvimento da tiroide tem sido descritos. Assim, ampliamos o estudo destes genes em pacientes diagnosticados com DTs. Nesta primeira etapa, realizamos o rastreamento de mutações por meio de sequenciamento genético pelo método de Sanger. Numa segunda etapa, em busca de eventuais novos genes candidatos de HC, investimos no estudo molecular por whole exome sequencing (WES). Neste sentido, desenvolvemos um algoritmo de decisões de bioinformática para a análise, tanto particularizada, quanto global de genes. Por meio deste algoritmo identificamos genes possivelmente relacionados ao fenótipo de diversas formas de DTs. Rastreamos dois genes candidatos inicialmente apontados pelo WES: oxidase dual 2 (DUOX2) e coiled-coil domain-containing protein 114 (CCDC114) em número adicional de pacientes. Além disso, seus respectivos mutantes foram estudados funcionalmente in vitro e in vivo (zebrafish). Usando WES e Sanger, identificamos variações no gene CCDC114 em pai e seu filho, assim como em 5 de 6 pacientes esporádicos com hemiagenesia. Análises funcionais in silico sugeriram que 3 das 6 variações eram deletérias em pelo menos dois programas de predição diferentes. Em análises funcionais in vivo, realizamos experimentos com doses crescentes de morfolino em embriões de zebrafish que mostraram um fenótipo de posicionamento tiroidiano e cardíaco alterados de forma aleatória, não sendo possível correlacionar as variantes deletérias de CCDC114 humano com a perda de função de seu ortólogo em zebrafish. Assim, apesar da ausência de fenótipo tiroidiano específico em zebrafish, observamos a associação de mutações no CCDC114 com a hemiagenesia em humanos. Usando a mesma abordagem, identificamos 15 variações no gene DUOX2 em pacientes com ectopia, sendo 7 novas: p.Gly201Glu, p.Leu264CysfsX57, p.Pro609Ser, p.Met650Thr, p.Glu810Ter, p.Met822Val e p.Glu1017Gly. Todas as crianças com mutações no DUOX2 segregaram com HC, o que foi confirmado pelos valores elevados de hormônio tiroestimulante, seja por ocasião da triagem neonatal, seja no diagnóstico confirmatório pós-natal. A cintilografia tiroidiana confirmou ectopia em todos os afetados. Estas mutações estão em heterozigose composta com variantes polimórficas funcionais previamente relacionadas com hipotiroidismo transitório ou permanente. Verificamos, in vitro, que 3 destas 7 mutações impedem a translocação do complexo DUOX2/DUOXA2 para a membrana e impactam sobre a atividade de DUOX2 e tiroperoxidase necessária para a síntese de hormônios tiroidianos. Nossos dados reforçam a utilidade da abordagem de WES para casos com etiopatogenia complexa. Parte dos genes apontados por WES foram achados inesperados, tendo-se como base a função primária desses genes já reportados na literatura, como no caso do DUOX2, em que, além do conhecido papel na hormonogênese, parece participar da ontogênese tiroidiana.
O hipotiroidismo congênito (HC) é uma das doenças endócrinas mais comuns entre recém-nascidos, com incidência de 1:1500-4000. O HC é causado, principalmente, por malformações embriológicas da tiroide, conhecidas como disgenesias tiroidianas (DTs). Acredita-se que as DTs são originadas a partir de alterações de especificação, proliferação e sobrevivência das células precursoras tiroidianas. Sabe-se que a embriogênese tiroidiana é controlada por diversos fatores de transcrição, entre esses NKX2-1, FOXE1, PAX8 e HHEX. Entretanto, apenas uma minoria dos pacientes com HC apresenta mutações nestes fatores de transcrição. Novos genes derivados de modelos animais relacionados ao desenvolvimento da tiroide tem sido descritos. Assim, ampliamos o estudo destes genes em pacientes diagnosticados com DTs. Nesta primeira etapa, realizamos o rastreamento de mutações por meio de sequenciamento genético pelo método de Sanger. Numa segunda etapa, em busca de eventuais novos genes candidatos de HC, investimos no estudo molecular por whole exome sequencing (WES). Neste sentido, desenvolvemos um algoritmo de decisões de bioinformática para a análise, tanto particularizada, quanto global de genes. Por meio deste algoritmo identificamos genes possivelmente relacionados ao fenótipo de diversas formas de DTs. Rastreamos dois genes candidatos inicialmente apontados pelo WES: oxidase dual 2 (DUOX2) e coiled-coil domain-containing protein 114 (CCDC114) em número adicional de pacientes. Além disso, seus respectivos mutantes foram estudados funcionalmente in vitro e in vivo (zebrafish). Usando WES e Sanger, identificamos variações no gene CCDC114 em pai e seu filho, assim como em 5 de 6 pacientes esporádicos com hemiagenesia. Análises funcionais in silico sugeriram que 3 das 6 variações eram deletérias em pelo menos dois programas de predição diferentes. Em análises funcionais in vivo, realizamos experimentos com doses crescentes de morfolino em embriões de zebrafish que mostraram um fenótipo de posicionamento tiroidiano e cardíaco alterados de forma aleatória, não sendo possível correlacionar as variantes deletérias de CCDC114 humano com a perda de função de seu ortólogo em zebrafish. Assim, apesar da ausência de fenótipo tiroidiano específico em zebrafish, observamos a associação de mutações no CCDC114 com a hemiagenesia em humanos. Usando a mesma abordagem, identificamos 15 variações no gene DUOX2 em pacientes com ectopia, sendo 7 novas: p.Gly201Glu, p.Leu264CysfsX57, p.Pro609Ser, p.Met650Thr, p.Glu810Ter, p.Met822Val e p.Glu1017Gly. Todas as crianças com mutações no DUOX2 segregaram com HC, o que foi confirmado pelos valores elevados de hormônio tiroestimulante, seja por ocasião da triagem neonatal, seja no diagnóstico confirmatório pós-natal. A cintilografia tiroidiana confirmou ectopia em todos os afetados. Estas mutações estão em heterozigose composta com variantes polimórficas funcionais previamente relacionadas com hipotiroidismo transitório ou permanente. Verificamos, in vitro, que 3 destas 7 mutações impedem a translocação do complexo DUOX2/DUOXA2 para a membrana e impactam sobre a atividade de DUOX2 e tiroperoxidase necessária para a síntese de hormônios tiroidianos. Nossos dados reforçam a utilidade da abordagem de WES para casos com etiopatogenia complexa. Parte dos genes apontados por WES foram achados inesperados, tendo-se como base a função primária desses genes já reportados na literatura, como no caso do DUOX2, em que, além do conhecido papel na hormonogênese, parece participar da ontogênese tiroidiana.
Descrição
Citação
KIZYS, Marina Malta Letro. Estudo molecular e funcional de genes identificados por sequenciamento paralelo em larga escala numa coorte de pacientes com hipotiroidismo congênito por disgenesias tiroidianas. 2016. 180 f. Tese (Doutorado em Medicina Translacional) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.