Assinaturas estromais e expressão de microRNAs relacionados à angiogênese em linfomas não-Hodgkin difuso de grandes células B

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Data
2014-11-26
Autores
Borges, Natalia Morais [UNIFESP]
Orientadores
Colleoni, Gisele Wally Braga [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most frequent aggressive non-Hodgkin lymphoma (NHL) and, despite advances in treatment, 30% of the cases are refractory or relapse after chemoimmunotherapy. Currently, the relationship between angiogenesis and angiomiRs in DLBCL is unknown. We classified 84 DLBCL according to stromal signatures using tissue microarray and immunohistochemistry (CD34, CD68 and SPARC). We also evaluated the expression of pro- and antiangiomiRs in paraffin embedded tissues of DLBCL by real-time PCR and correlate them with MVD. Approximately 40% of cases were classified as stromal-1, 50% were classified as stromal-2 and 10% were not classified. We observed increased expression of pro-angiomiRs Let-7f, miR-17, miR-18a, miR-19b, miR-126, miR-130a, miR-210, miR-296 and miR-378 in 14%, 57%, 30%, 45%, 12%, 12%, 56%, 58% and 48% of cases, respectively. Among antiangiomiRs we found decreased expression of miR-16, miR-20b, miR-92a, miR-221 and miR-328 in, respectively, 27%, 71%, 2%, 44% and 11%. When comparing the expression of angiomiRs with molecular subtypes according to the algorithm Hans et al. (2004) we found association between increased expression pro-angiomir miR-126, pro-angiomir miR-130a e antiangiomir miR-328 and the subtype ABC (non-GCB). However, only in the case of angiomiRs miR-16, miR-221 and miR-328 we were able to verify expression values compatible with angiogenesis, i.e., higher levels of the three antiangiomiRs in patients with low MVD and stromal-1 signature. The median overall survival has not been reached, with a maximum follow-up of 146.5 months. We observed worse outcome in Ann Arbor stage III/IV, high IPI and CD34 Quartiles III/IV (automated counting). IPI and CD34 confirmed independent impact on survival of the study group. Patients with high-risk IPI showed probability of evolving to death 3.4 times greater than the rest of the group and patients with higher MVD as automated counting (Quartiles III and IV) had chance of evolving to death two times higher than the rest of the group. MicroRNAs showed no prognostic significance in independent serum samples? cohort. Therefore, the stromal-2 signature was found in 50% of cases. We confirmed association between antiangiomirs miR-16, miR-221 and miR-328 and stromal-1 signature. Four angiomiRs emerge as potential therapeutic targets (differentially expressed in ~50% of cases): pro-angiomiRs miR-17, miR-210 and miR-296 and anti-angiomiR miR-20b. Although the four microRNAs seem to be important in DLBCL pathogenesis, they are not predictive of DLBCL onset or relapse.
A identificação de subtipos de linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) definidos pela expressão de assinaturas estromais identificadas por Lenz et al (2008) pode determinar novos caminhos no tratamento dessa doença com o uso de drogas anti-angiogênicas. A relação dessas assinaturas estromais com os pró- e antiangiomiRs é ainda desconhecida. Objetivos: 1) classificar os casos de LDGCB de acordo com a assinatura stromal-1 e stromal-2 usando tissue microarray (TMA) e imuno-histoquímica; 2) avaliar a expressão de pró- e antiangiomiRs em tecidos acometidos por LDGCB e emblocados em parafina; 3) correlacioná-las com as assinaturas estromais do tumor; 4) identificar possíveis biomarcadores ou alvos terapêuticos entre os angiomiRs diferencialmente expressos em LDGCB. Métodos: 84 LDGCB (NOS e subtipos, todos HIV negativo) admitidos no Hospital São Paulo entre 2000 e 2010 foram incluídos neste estudo. A expressão de CD68 e SPARC foi utilizada como marcadores do stromal-1. Para analisar a expressão de CD34 (MVD, stromal-2), realizamos contagem automatizada e manual de microvasos em todo o campo do TMA. Realizamos extração de microRNA (miRNA) das amostras de parafina usando RecoverAll ? Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE Tissues (Applied Biosystems). O PCR quantitativo em tempo real foi realizado utilizando TaqMan® Small RNA kit Assays, normalizado com U18 e RNU44. Pró-angiomiRs Let-7f, miR-17, miR-18a, miR-19b, miR-126, miR-130a, miR-210, miR-296 e miR-378 e antiangiomiRs miR-16, miR-20b, miR-92a, miR-221 e miR-328 foram selecionados para análise e foram considerados diferencialmente expressos quando os níveis de amostras tumorais foram 1,2 vezes superiores ou inferiores às amostras normais. Resultados: 40% dos casos foram classificados como stromal-1, 50% classificados como stromal-2 e 10% não foram classificados. Observamos aumento de expressão dos pró-angiomiRs Let-7f, miR-17, miR-18a, miR-19b, miR-126, miR-130a, miR-210, miR-296 e miR-378 em 14%, 57%, 30%, 45%, 12%, 12%, 56%, 58% e 48% dos casos, respectivamente. Entre os antiangiomiRs encontramos diminuição de expressão de miR-16, miR-20b, miR-92a, miR-221 e miR-328 em respectivamente 27%, 71%, 2%, 44% e 11%. Quando comparamos a expressão dos angiomiRs com os subtipos moleculares de acordo com o algoritmo de Hans et al (2004) encontramos associação entre aumento de expressão do pró-angiomiR miR-126, do pró-angiomiR miR-130a e do antiangiomiR miR-328 e o subtipo não-GCB. Somente nos casos dos angiomiRs miR-16, miR-221 e miR-328 pudemos verificar valores de expressão do angiomiRs compatíveis com a angiogênese, ou seja, maiores níveis dos três antiangiomiRs em situações de menor MVD (quartis I/II) e assinatura stromal-1. A sobrevida global mediana não foi atingida, com o tempo máximo de seguimento de 146,5 meses. Analisando a sobrevida global de acordo com as categorias de cada uma das variáveis clínicas ou laboratoriais, observamos pior evolução nos grupos classificados xv como estadiamento de Ann Arbor III/IV, IPI alto e CD34 Quartis III/IV. IPI e CD34 (contagem automatizada) confirmaram impacto independente na sobrevida do grupo estudado (p= 0,044 e 0,048, respectivamente). Os pacientes com IPI de alto risco apresentaram chance de evoluir para óbito 3,4 vezes maior do que o restante do grupo e os pacientes com maior MVD, conforme contagem automatizada (Quartis III e IV), apresentaram chance de evoluir para óbito 2 vezes maior do que o restante do grupo. Os microRNAs aqui avaliados não apresentaram importância prognóstica. Conclusão: A assinatura stromal-2 foi encontrada em 50% dos casos. Além disso, observamos correlação entre aumento da expressão dos miR-16, miR-221 e miR-328 (antiagiomiRs) na assinatura stromal-1. Quatro angiomiRs emergem como potenciais alvos terapêuticos: os pró-angiomiRs miR-17, miR-210 e miR-296 e o antiangiomiR miR-20b. Nosso estudo fornece novas informações sobre a importância dos miRNAs no desenvolvimento do DLBCL, podendo esses também serem explorados como alvos terapêuticos para pacientes com esta doença maligna de alta prevalência.
Descrição
Citação
BORGES, Natalia Morais. Assinaturas estromais e expressão de microRNAs relacionados à angiogênese em linfomas não-Hodgkin difuso de grandes células B. 2014. 144 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.