Estabelecimento e caracterização de cultura primária de tecido vaginal. Viabilidade do uso de terapia celular no tratamento de pacientes com síndrome de Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser
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Data
2015-12-31
Autores
Paula, Tatiane Aparecida de [UNIFESP]
Orientadores
Girão, Manoel Joao Batista Castello [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
The uterine and vaginal agenesis, also known as Syndrome Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (SMRKH) is a congenital malformation that, although rare, carries important clinical and psychological repercussions, due to the impairment of sexual activity and reproductive life. The treatment for this disease is divided into bloodless and surgical methods and consists in the construction of a neovagina, allowing the patient to have a normal sexual life. However, there is no consensus on best approach of treatment because of the advantages and disadvantages presented in both cases. Recently experimental studies described a successful technique of rabbit vaginal tissue engineering using samples of vagina and muscle autologous cells. In 2007 it was reported the first neovaginoplasty case with the MacIndoe modified technique were it was used the patient's own cells to produce an autologous vaginal tissue in the laboratory. Objectives: Our aim is to use the patient's own cells to produce an autologous vaginal tissue in the laboratory to be used in the near future in neovaginoplasty. Methods: We performed 05 full-thickness biopsies from vaginal vestibule of ~ 1cm2. After several washes in PBS with antibiotics, the tissue was minced into small pieces which were then put in culture plates with DMEM/F-12 supplemented with 10% of fetal bovine serum to allow cells to migrate from the explants. After cells reached 70% of confluence, the explants were removed so cells could grown to remaining spaces, at this moment the plates were harvested and cells were frozen in this first passage at density of 106 cells/vial, if we could not obtain this cell density, cells were further expanded and frozen at second passage. Using flow citometry, 03 samples were characterized using the following antibodies: CD90, CD73, CD105 and STRO-I for mesenchymal stem cells as well as pan-citokeratyn, CD133, CD9, CD227 and CD1d for epithelial cells, being the last two specifically used for vaginal epithelial cells. Finally we used CD34 for hematopoietic progenitor cells and vimentin for fibroblasts. The data was acquired using FACS Canto II ?BD Bioscience and analyzed with FlowJo 7.6.5 software. Results: Using explant technique we were able to obtain a mixed cell population of viable cells. These cells were characterized by 67% of mesenchymal stem cells (CD90+ CD73+ CD105+; SD=10,18,); we find high positivity of STRO-I cells (75,2%, SD=8,77) and vimetin (80,3%, SD=4,59). For most epithelial markers used we also find high values: 71,9% of CD133, 73,7% of CD9 and 80,3% of CD227 (SD= 6,7, 5,74 and 8,77 respectively). We found a weak positivity of citokeratyn and PDGFR-RB cells among the samples (13,6%, 0,52%, and 1,96%; 0,93%, 0,38%, 0,20% respectively) and a weak positivity of CD34 cells (14,7%, SD= 4,98). Conclusions: Using explant technique we were able to establish primary cell cultures from vaginal biopsies. Those cultures are characterized by having a mixed population of cells, namely, stem cells, epithelial cells and fibroblasts, showing that this approach could be used to obtain autologous vaginal tissue.
A agenesia vaginal e uterina, também conhecida como Síndrome de Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (SMRKH) é uma má formação congênita que, apesar de rara, traz repercussões clínicas e psicológicas importantes, devido ao comprometimento da atividade sexual e da vida reprodutiva. O tratamento desta anomalia, que visa permitir que a paciente tenha relações sexuais satisfatórias através da confecção de uma neovagina, divide-se em métodos incruentos e métodos cirúrgicos. Entretanto, ainda não há consenso sobre qual melhor abordagem a seguir devido a vantagens e desvantagens apresentadas em ambos os casos. Estudos experimentais descreveram uma bem sucedida técnica de engenharia tecidual vaginal em coelhas a partir de amostras de células vaginais e musculares autólogas. Em 2007 foi relatado o primeiro caso de neovaginoplastia com a técnica de MacIndoe modificada, que utilizou células da própria paciente para produzir um tecido vaginal autólogo em laboratório. Objetivo: Nosso objetivo foi estabelecer e caracterizar a cultura primária de células obtidas de tecido vaginal, para serem utilizados futuramente na neovaginoplastia. Métodos: Utilizamos tecido vaginal excedente de ~1cm2 de 5 pacientes submetidas a correção de prolapso vaginal. Inicialmente o tecido foi lavado várias vezes com PBS e antibiótico, depois cortado em pedaços pequenos e colocados na placa de cultura com DMEM/F-12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, permitindo que as células migrassem do explante. Depois que as células atingiram 70% de confluência, os explantes foram removidos, e as placas foram mantidas em cultura até que os espaços fossem cobertos. As células foram congeladas na primeira passagem na densidade de 106 cels/tubo, quando não atingia-se essa densidade, as células eram expandidas e subsequentemente congeladas na segunda passagem. Utilizando citometria de fluxo, 03 amostras foram caracterizadas, com os seguintes anticorpos: CD90, CD73, CD105, STRO-I e vimentina característico de células mesenquimais; CD227 e CD1d para células epiteliais vaginais; CD34 característico de células progenitoras hematopoiéticas; CD133, CD9 e citoqueratina característicos para células epiteliais; CD29 marcador de matriz extracelular e PDGFR-RB marcador para receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas. Após a leitura das amostras no citômetro FACSCanto II, os dados foram analisados com o uso do software FlowJo 7.6.5 Resultados: Utilizando a técnica de explante, conseguimos obter uma população de células viáveis e heterogênea, 67% das células foram caracterizadas em células mesenquimais (CD90+ CD73 + CD105+; SD= 10,18); encontramos alta expressão de STRO-I (75,2%, SD=8,77 e vimentina (80,3%, SD=4,59). Para os marcadores de células epiteliais encontramos: 71,9% de CD133, 73,7% de CD9 e 80,3% de CD227 (SD= 6, 7, 5,74 e 8,77 respectivamente). Entretanto, baixa expressão de citoqueratina e PDGFR-RB foram encontradas (13,6%, 0,52%, 1,96%; 0,93%, 0,38%, 0,20% respectivamente) e ainda expressão de CD34 (14,7%, SD= 4,98). Conclusão: Utilizando a técnica de explante, estabelecemos a cultura primária de tecido vaginal, a qual foi caracterizada células tronco mesenquimais, fibroblastos e células epiteliais.
A agenesia vaginal e uterina, também conhecida como Síndrome de Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (SMRKH) é uma má formação congênita que, apesar de rara, traz repercussões clínicas e psicológicas importantes, devido ao comprometimento da atividade sexual e da vida reprodutiva. O tratamento desta anomalia, que visa permitir que a paciente tenha relações sexuais satisfatórias através da confecção de uma neovagina, divide-se em métodos incruentos e métodos cirúrgicos. Entretanto, ainda não há consenso sobre qual melhor abordagem a seguir devido a vantagens e desvantagens apresentadas em ambos os casos. Estudos experimentais descreveram uma bem sucedida técnica de engenharia tecidual vaginal em coelhas a partir de amostras de células vaginais e musculares autólogas. Em 2007 foi relatado o primeiro caso de neovaginoplastia com a técnica de MacIndoe modificada, que utilizou células da própria paciente para produzir um tecido vaginal autólogo em laboratório. Objetivo: Nosso objetivo foi estabelecer e caracterizar a cultura primária de células obtidas de tecido vaginal, para serem utilizados futuramente na neovaginoplastia. Métodos: Utilizamos tecido vaginal excedente de ~1cm2 de 5 pacientes submetidas a correção de prolapso vaginal. Inicialmente o tecido foi lavado várias vezes com PBS e antibiótico, depois cortado em pedaços pequenos e colocados na placa de cultura com DMEM/F-12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, permitindo que as células migrassem do explante. Depois que as células atingiram 70% de confluência, os explantes foram removidos, e as placas foram mantidas em cultura até que os espaços fossem cobertos. As células foram congeladas na primeira passagem na densidade de 106 cels/tubo, quando não atingia-se essa densidade, as células eram expandidas e subsequentemente congeladas na segunda passagem. Utilizando citometria de fluxo, 03 amostras foram caracterizadas, com os seguintes anticorpos: CD90, CD73, CD105, STRO-I e vimentina característico de células mesenquimais; CD227 e CD1d para células epiteliais vaginais; CD34 característico de células progenitoras hematopoiéticas; CD133, CD9 e citoqueratina característicos para células epiteliais; CD29 marcador de matriz extracelular e PDGFR-RB marcador para receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas. Após a leitura das amostras no citômetro FACSCanto II, os dados foram analisados com o uso do software FlowJo 7.6.5 Resultados: Utilizando a técnica de explante, conseguimos obter uma população de células viáveis e heterogênea, 67% das células foram caracterizadas em células mesenquimais (CD90+ CD73 + CD105+; SD= 10,18); encontramos alta expressão de STRO-I (75,2%, SD=8,77 e vimentina (80,3%, SD=4,59). Para os marcadores de células epiteliais encontramos: 71,9% de CD133, 73,7% de CD9 e 80,3% de CD227 (SD= 6, 7, 5,74 e 8,77 respectivamente). Entretanto, baixa expressão de citoqueratina e PDGFR-RB foram encontradas (13,6%, 0,52%, 1,96%; 0,93%, 0,38%, 0,20% respectivamente) e ainda expressão de CD34 (14,7%, SD= 4,98). Conclusão: Utilizando a técnica de explante, estabelecemos a cultura primária de tecido vaginal, a qual foi caracterizada células tronco mesenquimais, fibroblastos e células epiteliais.
Descrição
Citação
PAULA, Tatiane Aparecida de. Estabelecimento e caracterização de cultura primária de tecido vaginal viabilidade do uso de terapia celular no tratamento de pacientes com síndrome de mayer-rokitansky-küster-hauser. 2015. 65 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.