Angiotensina (1-7) e Angiotensina II: indutoras de translocação de aquaporinas 2 transfectadas em células LLC-PK1
Nenhuma Miniatura disponível
Data
2016-10-31
Autores
Nogueira, Marie Doki [UNIFESP]
Orientadores
Casarini, Dulce Elena [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Introduction: When there is an increase in osmolality or a decrease in plasma volume, the hypothalamic receptors stimulate the pituitary to secrete the antidiuretic hormone arginine vasopressin (AVP). This hormone is recognized as the physiological stimulator of the translocation of AQP2 from cytoplasmic vesicles to the apical pole of the principal cells of the collecting duct, increasing water reabsorption until the osmotic equilibrium is reached. In addition to AVP, it has been shown that in primary IMCD cells, Ang II also has the ability to modulate AQP2 and this occurs through the AT1 receptor (AT1R), however, there are no reports on the ability of Ang- (1-7) to modulate the AQP2. Objectives: The aim of this study was to evaluate whether Ang (1-7) and Ang II would be able to translocate AQP2 present in LLC-PK1 cells, transfected with AQP2 (LLC-PK1-AQP2 in the presence or absence of the Losartan, PD-123319 and D-Ala-A779, antagonists of AT1R, AT2R and MasR respectively. Materials and Methods: The presence of AQP1 and AQP2, recombinant protein and microfilaments were visualized by immunofluorescence. The same method was used to observe the translocation of AQP2 present in LLC-PK1-AQP2 cells before and after treatment with Ang- (1-7) and Ang II in the presence or absence of Losartan, PD-123319 and D-Ala- A779. Phosphorylation of AQP2-S256 and S261 was analyzed by Western blotting at 2, 5, 15 and 30 minutes of treatment with Ang- (1-7) and Ang II in the presence or absence of Losartan, PD-123319 and D-Ala -A779. Gene modulation, after long-term stimuli, for 6, 12 and 24 hours with Ang- (1-7) and Ang II was analyzed by RT-PCR. For statistical analysis, one way Anova tests were used followed by Dunnet's multiple comparison test. Results: Our study showed: 1) Presence of AQP1 and AQP2 vesicles, both perinuclear and on the plasma membrane in LLC-PK1-AQP2 CT cells. 2) Presence of recombinant AQP2 in the plasma membrane of cells stimulated with AVP. 3) Change in microfilament organization in response to AVP, Ang- (1-7) and Ang II). 4) Ang- (1-7) and Ang II, were able to translocate the AQP2 vesicles from the cytoplasm to the plasma membrane. 5) Pre-treatments with Losartan, D-Ala-A779 and PD-123319, modulated the response of AQP2 and the phosphorylation levels obtained with Ang- (1-7) and Ang II. 6) Gene responses to AQP2 were statistically significant in the treatments of 6 h with AVP and in 24 h with Ang- (1-7). Conclusions: 1) For the first time, it has been shown that Ang- (1-7) is able to induce the translocation of AQP2 from cytoplasmic vesicles to the plasma membrane. 2) Ang- (1-7), appears to have a more effective effect on the increase in S256 phosphorylation and decrease in phosphorylation of S261 from AQP2 than Ang II. 3) There was a reorganization of actin microfilaments after stimulation with AVP, Ang- (1-7) and Ang II suggesting that these microfilaments are important in the targeting of AQP2 vesicles. 4) The previous inhibition with Losartan, D-ALA- (A779) and PD-123319 showed that Ang- (1-7) and Ang II can act through other receptors besides the specific ones, suggesting the formation of dimers or oligomers between these receptors. 5) The mixture of the three antagonists totally blocked the AQP2 translocation. 6) Ang- (1-7) increased the gene expression of AQP2 in 24h, suggesting to be a late gene inducer, compared to AVP.
Introdução: Quando ocorre aumento da osmolalidade ou diminuição do volume plasmático, os receptores hipotalâmicos estimulam a hipófise a secretar o hormônio antidiurético arginina vasopressina (AVP). Esse hormônio é reconhecido como o estimulador fisiológico da translocação da AQP2 de vesículas citoplasmáticas para o polo apical das células principais do ducto coletor, favorecendo o aumento da reabsorção de água, até que o equilíbrio osmótico seja alcançado. Além da AVP, já foi demonstrado que em células IMCD primárias, a Ang II também tem capacidade de modular a AQP2 e isso se dá através do receptor AT1 (AT1R), entretanto, não existem relatos sobre a capacidade da Ang-(1-7) de modular as AQP2. Objetivos: O objetivo deste trabalho foi avaliar se Ang (1-7) e Ang II seriam capazes de translocar as AQP2 presentes em células LLC-PK1 transfectadas com AQP2 (LLC-PK1-AQP2) na presença ou ausência de Losartan, PD-123319 e D-Ala-A779, antagonistas de AT1R, AT2R e MasR respectivamente. Materiais e Métodos: A presença das AQP1 e AQP2, da proteína recombinante e dos microfilamentos foram visualizadas por imunofluorescência. O mesmo método foi utilizado para a observação da translocação das AQP2 presentes nas células LLC-PK1-AQP2 antes e após tratamento com Ang-(1-7) e Ang II na presença ou ausência de Losartan, PD-123319 e D-Ala-A779. A fosforilação das S256 e S261 das AQP2, foi analisada por Western Blotting em 2, 5, 15 e 30 minutos de tratamento com Ang-(1-7) e Ang II na presença ou ausência de Losartan, PD-123319 e D-Ala-A779. A modulação gênica, após estímulos a longo prazo, por 6, 12 e 24 horas com Ang-(1-7) e Ang II foi analisada por RT-PCR. Para análise estatística, foram utilizados testes one way Anova seguido de Dunnet?s multiple comparison test. Resultados: Nosso estudo evidenciou: 1) Presença de vesículas de AQP1 e AQP2, tanto perinucleares quanto na membrana plasmática nas células LLC-PK1-AQP2 CT. 2) Presença de AQP2 recombinante na membrana plasmática de células estimuladas com AVP. 3) Mudança na organização dos microfilamentos em resposta a AVP, Ang-(1-7) e Ang II). 4) Ang-(1-7) e Ang II, foram capazes de translocar as vesículas de AQP2 do citoplasma para a membrana citoplasmática. 5) Pré tratamentos com Losartan, D-Ala-A779 e PD-123319, modularam a resposta da AQP2 e os níveis de fosforilação obtidas com Ang-(1-7) e Ang II. 6) Respostas gênicas para AQP2, foram estatísticamente significante nos tratamentos de 6 h com AVP e em 24h com Ang-(1-7). Conclusões: 1) Pela primeira vez, foi demonstrado que a Ang-(1-7) é capaz de induzir a translocação das AQP2 de vesículas citoplasmáticas para a membrana plasmática. 2) A Ang-(1-7), parece ter um efeito mais efetivo sobre o aumento na fosforilação S256 e diminuição na fosforilação da S261 das AQP2, do que a Ang II. 3) Houve reorganização dos microfilamentos de actina após estímulo com AVP, Ang-(1-7) e Ang II sugerindo que esses microfilamentos são importantes no direcionamento das vesículas de AQP2. 4) A inibição prévia com Losartan, D-ALA-(A779) e PD-123319 evidenciaram que Ang-(1-7) e Ang II podem atuar através de outros receptores além dos específicos, sugerindo a formação de dímeros ou oligômeros entre esses receptores. 5) A mistura dos três antagonistas, bloqueou totalmente a translocação da AQP2. 6) A Ang-(1-7) aumentou a expressão gênica de AQP2 em 24h, sugerindo ser um indutor gênico tardio, comparado à AVP.
Introdução: Quando ocorre aumento da osmolalidade ou diminuição do volume plasmático, os receptores hipotalâmicos estimulam a hipófise a secretar o hormônio antidiurético arginina vasopressina (AVP). Esse hormônio é reconhecido como o estimulador fisiológico da translocação da AQP2 de vesículas citoplasmáticas para o polo apical das células principais do ducto coletor, favorecendo o aumento da reabsorção de água, até que o equilíbrio osmótico seja alcançado. Além da AVP, já foi demonstrado que em células IMCD primárias, a Ang II também tem capacidade de modular a AQP2 e isso se dá através do receptor AT1 (AT1R), entretanto, não existem relatos sobre a capacidade da Ang-(1-7) de modular as AQP2. Objetivos: O objetivo deste trabalho foi avaliar se Ang (1-7) e Ang II seriam capazes de translocar as AQP2 presentes em células LLC-PK1 transfectadas com AQP2 (LLC-PK1-AQP2) na presença ou ausência de Losartan, PD-123319 e D-Ala-A779, antagonistas de AT1R, AT2R e MasR respectivamente. Materiais e Métodos: A presença das AQP1 e AQP2, da proteína recombinante e dos microfilamentos foram visualizadas por imunofluorescência. O mesmo método foi utilizado para a observação da translocação das AQP2 presentes nas células LLC-PK1-AQP2 antes e após tratamento com Ang-(1-7) e Ang II na presença ou ausência de Losartan, PD-123319 e D-Ala-A779. A fosforilação das S256 e S261 das AQP2, foi analisada por Western Blotting em 2, 5, 15 e 30 minutos de tratamento com Ang-(1-7) e Ang II na presença ou ausência de Losartan, PD-123319 e D-Ala-A779. A modulação gênica, após estímulos a longo prazo, por 6, 12 e 24 horas com Ang-(1-7) e Ang II foi analisada por RT-PCR. Para análise estatística, foram utilizados testes one way Anova seguido de Dunnet?s multiple comparison test. Resultados: Nosso estudo evidenciou: 1) Presença de vesículas de AQP1 e AQP2, tanto perinucleares quanto na membrana plasmática nas células LLC-PK1-AQP2 CT. 2) Presença de AQP2 recombinante na membrana plasmática de células estimuladas com AVP. 3) Mudança na organização dos microfilamentos em resposta a AVP, Ang-(1-7) e Ang II). 4) Ang-(1-7) e Ang II, foram capazes de translocar as vesículas de AQP2 do citoplasma para a membrana citoplasmática. 5) Pré tratamentos com Losartan, D-Ala-A779 e PD-123319, modularam a resposta da AQP2 e os níveis de fosforilação obtidas com Ang-(1-7) e Ang II. 6) Respostas gênicas para AQP2, foram estatísticamente significante nos tratamentos de 6 h com AVP e em 24h com Ang-(1-7). Conclusões: 1) Pela primeira vez, foi demonstrado que a Ang-(1-7) é capaz de induzir a translocação das AQP2 de vesículas citoplasmáticas para a membrana plasmática. 2) A Ang-(1-7), parece ter um efeito mais efetivo sobre o aumento na fosforilação S256 e diminuição na fosforilação da S261 das AQP2, do que a Ang II. 3) Houve reorganização dos microfilamentos de actina após estímulo com AVP, Ang-(1-7) e Ang II sugerindo que esses microfilamentos são importantes no direcionamento das vesículas de AQP2. 4) A inibição prévia com Losartan, D-ALA-(A779) e PD-123319 evidenciaram que Ang-(1-7) e Ang II podem atuar através de outros receptores além dos específicos, sugerindo a formação de dímeros ou oligômeros entre esses receptores. 5) A mistura dos três antagonistas, bloqueou totalmente a translocação da AQP2. 6) A Ang-(1-7) aumentou a expressão gênica de AQP2 em 24h, sugerindo ser um indutor gênico tardio, comparado à AVP.
Descrição
Citação
NOGUEIRA, Darie Doki. Angiotensina (1-7) e Angiotensina II: indutoras de translocação de aquaporinas 2 transfectadas em células LLC-PK1. 2016. 92 f. Tese (Doutorado em Medicina Translacional) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.