Avaliação funcional da enzima conversora de Angiotensina I (ECA) através de mutações sítio- dirigidas
Data
2016-07-26
Autores
Pereira, Larissa Miranda 
Orientadores
Casarini, Dulce Elena
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Hypertension is a worldwide health problem that is emerging in the population as a major public health challenges and considered a major risk factor for cardiovascular and renal disease. Several studies have focused on the renin-angiotensin system, which is described as an endocrine system, where renin, an aspartyl endopeptidase, cleaves angiotensinogen in the Leu10-Val11 bond and releases the decapeptide angiotensin I (AI), which is converted to angiotensin II (AII), by the action of angiotensin-converting enzyme (ACE). ACE is an enzyme target of several therapeutic studies, and thus, the search for better understanding of its structure is the goal of many researchers. Thus, this study aims to investigate the general role of amino acid residues in the ACE inhibitors captopril and lisinopril interaction with the site located in the N-terminal protein shown during the studies of the structure of the N-domain isoforms of ACE, as well as the role of these amino acids on the stability and functionality of the enzyme. Thus, in this project the ACE?s amino acids residues targets were Ala361, Thr378 and Phe467, strong candidates for the interaction with the ACE inhibitors. In this work, we altered the amino acid residues to alanine and analyzed the effect of this mutation in relation to the processes of ligand-enzyme interaction and functional activity. The Ala361was mutated to tryptophan to verify the spatial importance of this residue in the enzyme. As a result, we obtained three enzymes with the region correct changed that were separately purified and one pool was obtained from the purification process for each enzyme, all of them having ACE specific activity, with a very similar profile of structure that is proposed in the literature. Even though similar to wild type ACE, the mutant enzymes showed differences in the interaction with specific substrates and inhibitors, demonstrating that these proposals regions are important for the interaction with substrate and inhibitors, emphasizing the importance of the N-domain isoform, considered a possible genetic hypertension marker.
A hipertensão é um problema de saúde mundial que vem surgindo na população como um dos maiores desafios da saúde pública e considerada um grande fator de risco de patologia cardiovascular e renal. Atualmente, vários estudos têm como foco o Sistema Renina Angiotensina (SRA), o qual é descrito como um sistema endócrino, autócrino, parácrino e intrácrino, onde a renina, uma aspartil endopeptidase, cliva o angiotensinogênio na ligação Leu10-Val11 e libera o decapeptídeo angiotensina I (AI), que é convertido em angiotensina II (AII), pela ação da Enzima Conversora de Angiotensina I (ECA). A ECA, por apresentar grande importância fisiológica, é uma enzima alvo de vários estudos terapêuticos e, desta forma, a busca pelo melhor entendimento de sua estrutura é o objetivo de muitos pesquisadores. Assim, o presente trabalho tem como objetivo geral investigar o papel de resíduos de aminoácidos da ECA na interação com o inibidor lisinopril localizados no sítio N-terminal da proteína, evidenciados durante os estudos da estrutura das isoformas N-domínio da ECA com 90 e 65 kDa, bem como, o papel desses aminoácidos na estabilidade e funcionalidade da enzima. Desta forma, os resíduos alvos deste projeto foram Ala361, Thr378 e Phe467 da ECA, fortes candidatos para a interação com os inibidores de ECA, lisinopril e captopril. Neste trabalho, mutamos estes resíduos de aminoácidos para alanina e analisamos o efeito da mutação com relação aos processos de interação enzima-ligante e atividade funcional da mesma. O resíduo Ala361 foi mutado para triptofano para verificarmos a importância espacial deste resíduo na enzima. Como resultado, obtivemos as três enzimas alteradas na região de interesse, com a presença de um pool cromatográfico, todas elas apresentando atividade em substrato específico de ECA, com perfil de estrutura bastante similar ao proposto na literatura. Mesmo sendo similares à ECA selvagem, as enzimas mutantes apresentaram diferenças na interação com substratos e inibidores específicos, demonstrando que essas regiões propostas são importantes na interação a estes, enfatizando a importância da isoforma N-domínio da enzima, considerada um possível marcador genético de hipertensão.
A hipertensão é um problema de saúde mundial que vem surgindo na população como um dos maiores desafios da saúde pública e considerada um grande fator de risco de patologia cardiovascular e renal. Atualmente, vários estudos têm como foco o Sistema Renina Angiotensina (SRA), o qual é descrito como um sistema endócrino, autócrino, parácrino e intrácrino, onde a renina, uma aspartil endopeptidase, cliva o angiotensinogênio na ligação Leu10-Val11 e libera o decapeptídeo angiotensina I (AI), que é convertido em angiotensina II (AII), pela ação da Enzima Conversora de Angiotensina I (ECA). A ECA, por apresentar grande importância fisiológica, é uma enzima alvo de vários estudos terapêuticos e, desta forma, a busca pelo melhor entendimento de sua estrutura é o objetivo de muitos pesquisadores. Assim, o presente trabalho tem como objetivo geral investigar o papel de resíduos de aminoácidos da ECA na interação com o inibidor lisinopril localizados no sítio N-terminal da proteína, evidenciados durante os estudos da estrutura das isoformas N-domínio da ECA com 90 e 65 kDa, bem como, o papel desses aminoácidos na estabilidade e funcionalidade da enzima. Desta forma, os resíduos alvos deste projeto foram Ala361, Thr378 e Phe467 da ECA, fortes candidatos para a interação com os inibidores de ECA, lisinopril e captopril. Neste trabalho, mutamos estes resíduos de aminoácidos para alanina e analisamos o efeito da mutação com relação aos processos de interação enzima-ligante e atividade funcional da mesma. O resíduo Ala361 foi mutado para triptofano para verificarmos a importância espacial deste resíduo na enzima. Como resultado, obtivemos as três enzimas alteradas na região de interesse, com a presença de um pool cromatográfico, todas elas apresentando atividade em substrato específico de ECA, com perfil de estrutura bastante similar ao proposto na literatura. Mesmo sendo similares à ECA selvagem, as enzimas mutantes apresentaram diferenças na interação com substratos e inibidores específicos, demonstrando que essas regiões propostas são importantes na interação a estes, enfatizando a importância da isoforma N-domínio da enzima, considerada um possível marcador genético de hipertensão.
Descrição
Citação
PEREIRA, Larissa Miranda. Avaliação funcional da enzima conversora de Angiotensina I (ECA) através de mutações sítio- dirigidas. 2016. 102 f. Tese (Doutorado em Medicina Translacional) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.