Efeitos do anfenaco e de sua combinação com bevacizumabe sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do epitélio pigmentado retiniano
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Data
2015-06-30
Autores
Miyamoto, Cristina 
Orientadores
Burnier Junior, Miguel Noel Nascentes
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
OBJECTIVE: To evaluate the effects of amfenac (the active component of nepafenac) and its combination with bevacizumab on the secretion of pro-angiogenic and inflammatory cytokines by human retinal pigment epithelial cells. Additionally, to evaluate if chemical hypoxia with cobalt chloride, a hypoxia-mimicking agent, produces the same effect of the real hypoxia (hypoxia chamber) on the secretion of these cytokines by human retinal epithelial cells. METHODS: ARPE-19 cells were incubated under normoxia, chemical hypoxia, and real hypoxia. The cells were treated as follows: control, bevacizumab (0,25 mg/mL), amfenac (2 ng/mL), and the combination of bevacizumab (0,25 mg/mL) and amfenac (2,0 ng/mL). Media was harvested after 24h for sandwich ELISA-based angiogenesis and inflammation assays. The secretion of 10 pro-angiogenic cytokines: angiogenin, ANG-2, EGF, bFGF, HB-EGF, PDGF-BB, leptin, PIGF, HGF e VEGF; as well as of 10 inflammatory cytokines: IL-1?, IL-1?, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IFN-?, TNF-?, MCP-1, were measured. The viability/cytotoxicity was also assessed. RESUTS: Under normoxia, amfenac increased the secretion of ANG-2, HB-EGF, leptin, PDGF-BB, and PIGF, almost did not changed the secretion of EGF, and reduced the secretion of angiogenin, bFGF, HGF, and VEGF by ARPE-19 cells; the combination of the drugs elevated the secretion of all pro-angiogenic cytokines, except angiogenin, bFGF, and VEGF, whose secretion was diminished. Under chemical hypoxia, amfenac decreased the secretion of all pro-angiogenic cytokines, except ANG-2, whose secretion was increased, EGF whose secrection was practically unchanged and PIGF whose secretion was not detected by the method after the three treatments; the combination of the drugs reduced the secrection of all pro-angiogenic cytokines, except ANG-2 and HGF whose secretion were raised, and PIGF whose secretion was virtually the same. Under real hypoxia, amfenac increased the secretion of all pro-angiogenic cytokines, except angiogenin, bFGF and VEGF, whose secretion was decreased; the combination of the drugs increased the secretion of all pro-angiogenic cytokines, except VEGF. Under normoxia, amfenac practically did not altered the secretion of IL-1? and IL-13, reduced the secretion of IL-1?, IL-4, IL-8, and IL-10, and increased the secretion of IL-6, MCP-1, and TNF-?; the combination of the drugs virtually did not modified the secretion of IL-1?, IL-8, and IL-10, diminished the secretion of IL-1?, and increased the secretion of the remaining inflammatory cytokines. Under chemical hypoxia, amfenac practically did not changed the secretion of IL-1?, IL-1?, and IFN-?, reduced the secretion of IL-10, IL-13, and TNF-?, and elevated the secretion of all other inflammatory cytokines; the combination of the drugs virtually did not modified the secretion of IL-1?, decreased the secretion of IL-10, IL-13, and TNF-?, and increased the secretion of the remaining inflammatory cytokines. Under real hypoxia, amfenac reduced the secretion of all inflammatory cytokines; the combination of the drugs also decreased the secretion of the inflammatory cytokines apart from IFN-?, whose secretion increased; the combination of the drugs caused a more pronounced reduction in the secretion of the inflammatory cytokines (except MCP-1) compared to bevacizumab. These results were not statistically significant. All the treatments did not reduced the viability of the ARPE-19 cells under normoxia, chemical hypoxia and real hypoxia. Comparing the chemical hypoxia with cobalt chloride and the real hypoxia, the chemical hypoxia produced statistically different results regarding the secretion of 8 out of 10 pro-angiogenic cytokines (except EGF and HB-EGF), and the secretion of two inflammatory cytokines (IL-6 and IL-8). CONCLUSIONS: Amfenac reduced the secretion of pro-angiogenic cytokines (angiogenin, bFGF, and VEGF) and the secretion of all inflammatory cytokines under real hypoxia. Besides, except from MCP-1 and IFN-?, the combination of amfenac with bevacizumab tends to cause higher reduction of the levels of inflammatory cytokines secreted by ARPE-19 cells under real hypoxia than bevacizumab alone. Nepafenac may be a worth therapy for exudative AMD in combination with bevacizumab with additional benefits like the reduction of the frequency of intravitreal injections of anti-VEGF. Further studies are necessary to confirm this hypothesis. Compared with real hypoxia, the chemical hypoxia produced different results, sometimes statistically significant, regarding the levels of the pro-angiogenic and inflammatory cytokines secreted by ARPE-19 cells. This suggests that some cytokines function primarily associated with HIF-1?, while others do not.
Objetivo: Avaliar os efeitos do anfenaco (princípio ativo do nevanaco) e de sua combinação com o bevacizumabe sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do epitélio pigmentado retiniano (EPR). Adicionalmente, verificar se a hipóxia simulada com cloreto de cobalto (hipóxia química) tem o mesmo efeito que a hipóxia real (câmara de hipóxia) sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do EPR. Métodos: Células do epitélio pigmentado retiniano humano (ARPE-19) foram incubadas sob condições de normóxia, hipóxia química e hipóxia real. Os experimentos consistiram em quatro condições de tratamento: controle, bevacizumabe (0,25 mg/mL), anfenaco (2 ng/mL) e bevacizumabe (0,25 mg/mL) + anfenaco (2,0 ng/mL). Após 24 horas de tratamento, o meio de cultura das células foi colhido para análise dos níveis de 10 citocinas pró-angiogênicas: angiogenina, ANG-2, EGF, bFGF, HB-EGF, PDGF-BB, leptina, PIGF, HGF e VEGF, e 10 citocinas inflamatórias: IL-1?, IL-1?, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IFN-?, TNF-?, MCP-1. Para essa análise foram utilizadas técnicas que trabalham sob os mesmos princípios que o teste imunoenzimático ELISA (angiogenesis array e inflammation array). A viabilidade celular/citotoxicidade foi avaliada pelo LIVE/DEAD® viability/cytotoxicity kit da Invitrogen. Resultados: Sob normóxia, anfenaco aumentou a secreção de ANG-2, HB-EGF, leptina, PDGF-BB e PIGF, quase não alterou a secreção de EGF e reduziu a secreção de angiogenina, bFGF, HGF e VEGF; sua combinação com bevacizumabe aumentou a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto angiogenina, bFGF e VEGF, que tiveram sua secreção diminuída. Sob hipóxia química, anfenaco reduziu a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto a de ANG-2, que teve sua secreção aumentada, EGF e bFGF (tiveram secreção praticamente inalterada) e PIGF (que teve níveis indetectáveis pelo método sob efeito dos três tratamentos); sua combinação com bevacizumabe reduziu a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto ANG-2 e HGF, que tiveram sua secreção aumentada, e PIGF que apresentou níveis indetectáveis. Sob hipóxia real, anfenaco aumentou a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto angiogenina, bFGF e VEGF, que tiveram sua secreção diminuída; sua combinação com bevacizumabe aumentou a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto VEGF. Sob normóxia, anfenaco quase não alterou a secreção de IL-1? e IL-13, reduziu a secreção de IL-1?, IL-4, IL-8, IL-10 e IFN-?, e aumentou a secreção de IL-6, MCP-1 e TNF-?; sua combinação com bevacizumabe quase não alterou a secreção de IL-1?, IL-8 e IL-10, reduziu a secreção de IL-1? e aumentou a secreção das demais citocinas inflamatórias. Sob hipóxia química, anfenaco quase não alterou a secreção de IL-1?, IL-1? e IFN-?, reduziu a secreção de IL-10, IL-13 e TNF-?, e aumentou a secreção das demais citocinas inflamatórias; sua combinação com bevacizumabe quase não alterou a secreção de IL-1?, reduziu a de IL-10, IL-13 e TNF-?, e aumentou a secreção das demais citocinas inflamatórias. Sob hipóxia real, anfenaco reduziu a secreção de todas as citocinas inflamatórias; sua combinação com bevacizumabe também reduziu a secreção das citocinas inflamatórias, exceto a de IFN-?, que apresentou aumento de sua secreção; a combinação das drogas causou maior redução dos níveis de citocinas inflamatórias (exceto MCP-1) que bevacizumabe. Esses resultados não foram estatisticamente significantes. Os três tratamentos não reduziram a viabilidade das células ARPE-19 sob normóxia, hipóxia química e hipóxia real. A hipóxia simulada com cloreto de cobalto (hipóxia química) produziu diferença estatisticamente significante sobre a secreção de oito das dez citocinas pró-angiogênicas (exceto EGF e HB-EGF) e de duas citocinas inflamatórias (IL-6 e IL-8) comparada com o efeito produzido pela hipóxia real. Conclusões: Anfenaco reduziu a secreção de citocinas pró-angiogênicas (angiogenina, bFGF e VEGF) e de todas as inflamatórias sob hipóxia real. Além disso, com exceção da proteína quimiotática de monócito-1 (MCP-1) e interferon-gama (IFN-?), a combinação de anfenaco com bevacizumabe tendeu a provocar maior redução dos níveis de citocinas inflamatórias secretados pelas células do EPR sob hipóxia real que bevacizumabe sozinho. É possível que nepafenaco seja uma terapia válida para DMRI exsudativa em combinação com bevacizumabe podendo trazer benefícios adicionais como a redução da frequência de injeções intravítreas de anti-VEGF; mais estudos são necessários para confirmar essa hipótese. A hipóxia simulada com cloreto de cobalto (hipóxia química) produz diferenças (às vezes, significativa) na secreção de citocinas próangiogênicas e inflamatórias comparada à hipóxia real. Isso sugere que algumas citocinas têm sua função primariamente relacionada ao fator induzido pela hipóxia-1 alfa (HIF-1?), enquanto outras não.
Objetivo: Avaliar os efeitos do anfenaco (princípio ativo do nevanaco) e de sua combinação com o bevacizumabe sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do epitélio pigmentado retiniano (EPR). Adicionalmente, verificar se a hipóxia simulada com cloreto de cobalto (hipóxia química) tem o mesmo efeito que a hipóxia real (câmara de hipóxia) sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do EPR. Métodos: Células do epitélio pigmentado retiniano humano (ARPE-19) foram incubadas sob condições de normóxia, hipóxia química e hipóxia real. Os experimentos consistiram em quatro condições de tratamento: controle, bevacizumabe (0,25 mg/mL), anfenaco (2 ng/mL) e bevacizumabe (0,25 mg/mL) + anfenaco (2,0 ng/mL). Após 24 horas de tratamento, o meio de cultura das células foi colhido para análise dos níveis de 10 citocinas pró-angiogênicas: angiogenina, ANG-2, EGF, bFGF, HB-EGF, PDGF-BB, leptina, PIGF, HGF e VEGF, e 10 citocinas inflamatórias: IL-1?, IL-1?, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IFN-?, TNF-?, MCP-1. Para essa análise foram utilizadas técnicas que trabalham sob os mesmos princípios que o teste imunoenzimático ELISA (angiogenesis array e inflammation array). A viabilidade celular/citotoxicidade foi avaliada pelo LIVE/DEAD® viability/cytotoxicity kit da Invitrogen. Resultados: Sob normóxia, anfenaco aumentou a secreção de ANG-2, HB-EGF, leptina, PDGF-BB e PIGF, quase não alterou a secreção de EGF e reduziu a secreção de angiogenina, bFGF, HGF e VEGF; sua combinação com bevacizumabe aumentou a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto angiogenina, bFGF e VEGF, que tiveram sua secreção diminuída. Sob hipóxia química, anfenaco reduziu a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto a de ANG-2, que teve sua secreção aumentada, EGF e bFGF (tiveram secreção praticamente inalterada) e PIGF (que teve níveis indetectáveis pelo método sob efeito dos três tratamentos); sua combinação com bevacizumabe reduziu a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto ANG-2 e HGF, que tiveram sua secreção aumentada, e PIGF que apresentou níveis indetectáveis. Sob hipóxia real, anfenaco aumentou a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto angiogenina, bFGF e VEGF, que tiveram sua secreção diminuída; sua combinação com bevacizumabe aumentou a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto VEGF. Sob normóxia, anfenaco quase não alterou a secreção de IL-1? e IL-13, reduziu a secreção de IL-1?, IL-4, IL-8, IL-10 e IFN-?, e aumentou a secreção de IL-6, MCP-1 e TNF-?; sua combinação com bevacizumabe quase não alterou a secreção de IL-1?, IL-8 e IL-10, reduziu a secreção de IL-1? e aumentou a secreção das demais citocinas inflamatórias. Sob hipóxia química, anfenaco quase não alterou a secreção de IL-1?, IL-1? e IFN-?, reduziu a secreção de IL-10, IL-13 e TNF-?, e aumentou a secreção das demais citocinas inflamatórias; sua combinação com bevacizumabe quase não alterou a secreção de IL-1?, reduziu a de IL-10, IL-13 e TNF-?, e aumentou a secreção das demais citocinas inflamatórias. Sob hipóxia real, anfenaco reduziu a secreção de todas as citocinas inflamatórias; sua combinação com bevacizumabe também reduziu a secreção das citocinas inflamatórias, exceto a de IFN-?, que apresentou aumento de sua secreção; a combinação das drogas causou maior redução dos níveis de citocinas inflamatórias (exceto MCP-1) que bevacizumabe. Esses resultados não foram estatisticamente significantes. Os três tratamentos não reduziram a viabilidade das células ARPE-19 sob normóxia, hipóxia química e hipóxia real. A hipóxia simulada com cloreto de cobalto (hipóxia química) produziu diferença estatisticamente significante sobre a secreção de oito das dez citocinas pró-angiogênicas (exceto EGF e HB-EGF) e de duas citocinas inflamatórias (IL-6 e IL-8) comparada com o efeito produzido pela hipóxia real. Conclusões: Anfenaco reduziu a secreção de citocinas pró-angiogênicas (angiogenina, bFGF e VEGF) e de todas as inflamatórias sob hipóxia real. Além disso, com exceção da proteína quimiotática de monócito-1 (MCP-1) e interferon-gama (IFN-?), a combinação de anfenaco com bevacizumabe tendeu a provocar maior redução dos níveis de citocinas inflamatórias secretados pelas células do EPR sob hipóxia real que bevacizumabe sozinho. É possível que nepafenaco seja uma terapia válida para DMRI exsudativa em combinação com bevacizumabe podendo trazer benefícios adicionais como a redução da frequência de injeções intravítreas de anti-VEGF; mais estudos são necessários para confirmar essa hipótese. A hipóxia simulada com cloreto de cobalto (hipóxia química) produz diferenças (às vezes, significativa) na secreção de citocinas próangiogênicas e inflamatórias comparada à hipóxia real. Isso sugere que algumas citocinas têm sua função primariamente relacionada ao fator induzido pela hipóxia-1 alfa (HIF-1?), enquanto outras não.
Descrição
Citação
MIYAMOTO, Cristina. Efeitos do anfenaco e de sua combinação com bevacizumabe sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do epitélio pigmentado retiniano. 2015. 115 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.