A cisteína proteinase de 30kDa de Leishmania (L.) chagasi: implicação em resposta imune humoral e celular na leishmaniose visceral
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Date
2004
Authors
Aleixo, Suzana Dias [UNIFESP]
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Barbiéri, Clara Lúcia [UNIFESP]
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Tese de doutorado
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Abstract
O enfoque desse trabalho foi a clonagem e expressão do gene codificador da cisteína proteinase de 30 kDa (p30) de Leishmania (L.) chagasi, Ldccys1, visando à utilização do DNA e da proteína recombinantes em ensaios de imunização ativa de camundongos BALB/c. O antígeno recombinante foi também utilizado para a avaliação das respostas imunes humoral e celular desencadeadas em pacientes portadores de leishmaniose visceral americana. A estratégia para a clonagem do gene Ldccys1 foi sua amplificação por PCR utilizando "primers" correspondentes à fase de leitura aberta completa do gene Ldccys1 depositada no GeneBank e DNA genômico de amastigotas de L. (L.) chagasi. Foi amplificado um produto de 1.3 kb (clone 1.3) cuja seqüência de nucleotídeos apresentou alta identidade com outras seqüências de genes de cisteína proteinases de Leishmania descritas, como as dos genes cpb de L. (L.) infantum, cpb18 de L. (L.) mexicana e Lpcys2 de L. (L.) pifanoi. A seqüência predita de aminoácidos da Ldccys1 mostrou que a proteína apresenta todos os aminoácidos conservados característicos das cisteína proteinases e que foram anteriormente identificados na seqüência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene Ldccys1. A subclonagem e expressão do clone 1.3 no vetor pHIS resultou em uma proteína recombinante de 47 kDa (rLdccys1) que foi reconhecida em experimentos de "Westem blotting" pelo AcMo 2E5D3, reativo com a p30 nativa de L. (L.) chagasi. Assim como o AcMo 2E5D3, o soro de camundongos imunizados com a rLdccys1 reagiu com duas bandas, de 27 e 30 kDa, dos extratos de promastigotas e amastigotas de L. (L.) chagasi. A reatividade do AcMo 2E5D3 com a proteína recombinante e a do soro anti-rLdccys1 com a p30 dos extratos do parasita mostrou que o gene Ldccys1 corresponde ao gene p30 de L. (L.) chagasi. A localização da Ldccys1 foi determinada utilizando o soro de camundongo anti-rLdccys1 em experimentos de imunomarcação em nível de microscopia eletrônica e microscopia confocal, demonstrando-se que a proteína está confinada a megassomos de amastigotas de L. (L.) chagasi, reforçando a presença dessa organela que foi descrita por nosso grupo nesse parasita utilizando o AcMo 2E5D3. A imunização com o gene Ldccysl induziu forte resposta humoral em camundongos BALB/c, com produção das subclasses IgG1, IgG2a e IgG2b. As células esplênicas desses animais não apresentaram respostas linfoproliferativas quando reestimuladas com os antígenos de L. (L.) chagasi, entre eles a rLdccys1, porém foram capazes de produzir IFN-, IL-4 e IL-10, indicando que a vacinação com o gene…(au).
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São Paulo: [s.n.], 2004. 117 p.