Navegando por Palavras-chave "Regeneração tecidual"

Agora exibindo 1 - 4 de 4
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Análise da incorporação de ácidos graxos ômega-3 (EPA e DHA) na membrana celular de mioblastos C2C12: avaliação dos efeitos na proliferação e diferenciação celular
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-09-11) Monteiro, Daniela Carvalho [UNIFESP]; Moreira, Vanessa [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1310560200014128; http://lattes.cnpq.br/4745332502370423
    Objetivo: Analisar o grau de incorporação dos ácidos graxos do tipo ômega-3 ácido eicosapentaeinoico (EPA) e docosahexaenoico (DHA) em membrana de mioblastos C2C12 cultivados em cultura celular e suplementado com nanoemulsão de óleo de peixe (NOP). Avaliar esse efeito sobre a proliferação e diferenciação destas células miogênicas com especial ênfase na resolvina E1 (RvE1). Métodos: Células C2C12 mioblásticas de camundongo foram cultivadas com NOP (25 µM de EPA) por 3 a 5 dias em protocolo de cultivo das células em proliferação ou diferenciação, respectivamente. A análise do grau de incorporação de EPA e DHA foi realizada em cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG/MS). De outra parte, as células foram previamente incubadas com inibidor do receptor de BLT1 (LY293111- 0,25 M) ou com os inibidores da via de sinalização do receptor CMKLR1/ChemR23 (rapamicina, 0,08 µM- inibidor de mTOR, ou wortmanina, 500 nM, inibidor de PI3K) seguida pela fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de Crotalus durissus terrificus (0,16 M). Após 24 h, foram realizadas as análises da expressão proteica de BLT1, COX-2, CYP450, MyoD e Myf-5 (proliferação) e CMKLR1/ChemR23 e Myf-6 (diferenciação) por western blotting. Ainda o grau de proliferação foi analisado pelo padrão de incorporação de BrDU, por espectrofotometria. Resultados: Os resultados mostraram que as células cultivadas com NOP, em meio proliferativo, apresentaram aumento (p>0,05) no teor de EPA e DHA (118,41±13,51 e 5,43±0,64 µg/mg, respectivamente), quando comparadas às células controle (18, 91±2.24 e 0,74±0,10 µg/mg de proteína, respectivamente). De forma semelhante, mioblastos incubados por 6 dias com NOP até atingir a confluência de 100% (protocolo experimental de diferenciação) apresentaram elevação (p<0,05) no teor de EPA e DHA (139,41 ±24,0 e 70,63 ± 11,43 µg/mg de proteína, respectivamente), quando comparadas às células incubadas com meio de cultura apenas (controle) (45,96 ± 1,44 e 16,23 ± 1,07 µg/mg de proteína, respectivamente). Apenas as células em proliferação incubadas com FLA2 e suplementadas com NOP apresentaram aumento de 25% e 30%, nos níveis de expressão proteica de COX-2 e CYP450 4A (p<0,05), respectivamente. As células em proliferação, incubadas com FLA2 e não suplementadas com NOP apresentaram aumento nos níveis de BLT1 (35%), enquanto as em diferenciação apresentaram diminuição de 60% na expressão deste receptor. Quando suplementadas com NOP não apresentaram alteração na expressão de BLT1. Apenas mioblastos em diferenciação e incubadas com FLA2 apresentaram redução da expressão de CMKLR1 (35%). Mioblastos suplementados ou não com NOP, na presença da FLA2, apresentaram aumento significativo de 90 e 25%, respectivamente, na incorporação do BrdU. Por outro lado, a associação com com Ly293111, levou à diminuição significativa de 26 e 43%, na incorporação do BrdU. As células incubadas com FLA2 e o inibidor do receptor BLT1 (Ly293111) apresentaram redução significativa da expressão de Myf5 e MyoD enquanto as células em prolfieração com NOP não apresentaram alteração nos níveis de expressão proteica destes fatores miogênicos. Células em diferenciação cultivadas com NOP e FLA2 apresentam diminuição da expressão de MyoD de forma significativa (15%). No entanto, estas células quando incubadas com FLA2 associada ao rapamicina, mas não com wortmanina ou Ly293111, apresentaram elevação significativa (65%) da expressão de MyoD. A análise morfológica da miofibras em células C2C12 pré-suplementadas com NOP indicou a formação de fibras mais espessas. Conclusões: A suplementação de mioblastos C2C12 com NOP aumenta a incorporação de EPA e DHA, favorecendo a produção de mediadores lipídicos pró-resolutivos. A presença de receptores BLT1 e do receptor CMKLR1/ChemR23 evidencia a atividade modulatória de RVE1 sobre a proliferação e diferenciação dos mioblastos C2C12; o aumento da proliferação das células C2C12 induzida pela FLA2 via receptor BLT1 pode ser mediada pela RVE1, mas independente dos fatores Myf5 e MyoD; Mioblastos suplementadas com EPA e DHA apresentam mais formação de miotubos espessos.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Aplicações da bioengenharia tecidual e do potencial anti-inflamatório e pró-angiogênico da proteína anexina A1 em heteroenxertos de pele acelular
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2016-03-30) Mimura, Kallyne Kioko Oliveira [UNIFESP]; Oliani, Sonia Maria [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/5102737730539655; http://lattes.cnpq.br/8017096776183586; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    The development of skin substitutes is essential to overcome the shortage at organs transplantation. Furthermore, the use of drugs to modulate the inflammation and angiogenesis processes is important to the successful tissue regeneration. Objectives: The aims of our investigations were to standardize techniques of porcine skin decellularization, to develop acellular skins matrix (scaffolds) without cross-linking, to evaluate its biocompatibility and the anti-inflammatory / pro-angiogenic potential of the AnxA12-26 peptide of the annexin A1 protein in heterologous transplants. Materials and methods: Scaffolds (1 and 2), produced without cross-linking by two types of decellularization protocols (osmotic shock and enzymatic digestion), were evaluated by histological, molecular and biomechanical methods. For the biocompatibility analysis, the scaffolds and Permacol? as control (commercially available porcine dermal scaffold with crosslinking) were implanted in rats (Rattus norvegicus) for 3, 14, 21 and 90 days. The peripheral blood was collected for leukocytes quantification and plasma was isolated for the pro-inflammatory cytokines IL-6, TNF-? and IL-1? measurement. The implants and the surrounding tissues were processed for histological, immuno-histochemical (blood vessels, myofibroblasts, IL-6 positive cells and ED-1 / CCR7 / CD163 positive macrophages) and molecular (IL-1?, VEGF-A, TGF-?1, COL3A1, COL1A1 and COL1A2) analysis. In the following experiments, the scaffold 1, that presented the best biological properties, was used for transplantation in Balb/c mice, treated or not i.p. with 4 mg/kg AnxA12-26 peptide, for 3, 10, 15 and 60 days. The leukocytes were quantified on peripheral blood. The transplanted scaffolds and adjacent tissue were processed for histological, biochemical (cytokines and growth factors measurement) and molecular (VEGF-A, FGF-b, TGF-?1 and ?-SMA) analysis. Results: The decellularization methods were effective in both scaffolds (1 and 2), with preservation of extracellular matrix components (collagen and glycosaminoglycans) and adequate tensile strength at biomechanical testing. Initially, on 3rd day post-implantation, polymorphonuclear cells were observed inside scaffolds and were gradually replaced by IL-6 positive cells and M1 macrophages, at the 14th day. After 21 days, M2 macrophages, myofibroblasts and blood vessels were observed inside the scaffold. The cellular events observed in heterograft were consistent with the gene expression of investigated trophic factors, which were involved in tissue remodeling (IL-1?, TGF- ?1, VEGF-A, COL1A1, COL1A2 and COL3A1). The peptide AnxA12-26 administration in heterologous transplants was effective, promoting the reduction of proinflammatory mediators (IL-1?, IL-6, TNF-?, IL-17 and IFN-?) and increasing of cellular infiltration, pro-angiogenic factors expression (VEGF-A, b-FGF and TGF-?1) and myofibroblasts recruitment. Conclusion: Together, our results show the efficiency of the two decellularization protocols, indicating that both scaffolds are biologically compatible, allowing the cells recruitment and tissue remodeling with the gradual replacement of the acellular matrix. Moreover, our data reveals an important role of the AnxA1 protein in angiogenic and inflammatory processes on the experimental model of acellular skin heterologous transplants.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Efeito do peptídeo mimético Ac9-22, derivado da Anexina A1, sobre a degeneração e regeneração muscular esquelética, induzida pelo veneno da serpente Bothrops asper
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-02-09) Alecrim, Nicolas Nascimento [UNIFESP]; Moreira, Vanessa [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1310560200014128; http://lattes.cnpq.br/7793670939300094
    Os acidentes ofídicos são um problema de saúde pública de ordem mundial, sendo que na América Latina, a maioria dos acidentes são causados pelas serpentes do gênero Bothrops, os quais caracterizados por manifestações clínicas sistêmicas e locais. Dentre os efeitos locais destacamos a mionecrose, alterações na matriz extracelular, ruptura da microcirculação e proeminente reação inflamatória, as quais são causados por miotoxinas fosfolipásicas e metaloproteinases. Estas alterações locais prejudicam o processo de regeneração do tecido muscular, podendo resultar em fibrose e possível perda de função muscular. A soroterapia antiofídica é eficiente no tratamento dos efeitos sistêmicos, mas não é efetiva para sanar os efeitos locais causados pelo veneno, como a inflamação e a injúria tecidual. Com isso, se faz necessário a investigação de novos agentes para terapias auxiliares ao tratamento. A Anexina 1 (AnxA1), uma proteína endógena localizada na superfície de vários tipos celulares, exerce efeitos biológicos variados em diversos sistemas, como atividade anti-inflamatória, manutenção de integridade do citoesqueleto e da matriz extracelular, apoptose, além de estimulação de proliferação e diferenciação celular. Neste contexto, os peptídeos miméticos da AnxA1 podem ser considerados novas fontes de moléculas terapêuticas, pois mantêm a atividade da proteína endógena. O objetivo do presente estudo foi testar a atividade do peptídeo Ac9-22, derivado da AnxA1, sobre a degeneração e regeneração do tecido muscular esquelético, após injúria induzida pelo veneno de serpente Bothrops asper (VBa), quanto: i) à função contrátil do tecido e ii) à produção de TGFβ, IL-1β, IL-6 e VEGF. Grupos distintos de camundongos Swiss machos (CEUA 1996230920) receberam VBa i.m. (50 µg/50 µL) no músculo gastrocnêmio direito ou solução salina (SS) no músculo contralateral (controle). Após 30 min, 24, 48 e 72 h da injeção i.m., grupos distintos de camundongos foram tratados por via intraperitoneal (i.p.) com Ac9-22 (1 mg/kg), ou SS. Após 3, 7 e 28 dias do tratamento i.m., os músculos foram coletados para análise da função contrátil (curva de força X frequência e curva de fadiga), além de quantificação de IL-1β, IL-6, TNF-α e VEGF em homogenato do tecido muscular por enzimaimunoensaio. No período de regeneração (28 dias), os músculos dos animais tratados com VBa i.m. e SS i.p. apresentaram maior resistência à fadiga (p<0,05) quando comparados aos grupos controles (SS i.m.+ SS i.p.), enquanto o músculo do grupo tratado com VBa i.m. e Ac9-22 i.p. apresentou resistência à fadiga similar ao grupo SS i.m. + SS i.p. (controle). Quanto ao teste de força X frequência não foram obtidas alterações significativas entre os grupos estudados. Animais tratados com Ac9-22 i.p. apresentaram elevada produção VEGF tecidual (p<0,05), após 7 e 28 dias do tratamento com VBa i.m, quando comparados aos animais VBa i.m.+ SS i.p. dos mesmos períodos. Na fase degenerativa (3 dias) animais VBa+Ac9-22 apresentaram diminuição significativa (p<0,05) dos níveis teciduais de IL-1β, mas não de IL-6 e TNF-α, comparados aos grupos VBa.+SS. Por outro lado, músculos de animais VBa+Ac9-22 apresentaram aumento significativo (p<0,05) de produção de IL-1β, IL-6, TNF-α, (p<0,05), no período inicial da regeneração (7 dias), quando comparados aos respectivos grupos VBa+SS. A partir dos resultados obtidos, o peptídeo mimético da ANX1, Ac9-22, é capaz de promover eventos que levam à aceleração e recobramento da atividade funcional do tecido muscular em regeneração, por meio da ativação de agentes pró-angiogênico e pró-miogênico, e por diminuir o processo inflamatório agudo e degenerativo, por inibir produção de citocinas pro-inflamatórios, induzida pela injeção do VBa. Dessa maneira, este peptídeo pode ser considerado um potencial protótipo terapêutico, para ser aplicado no tratamento e melhora da qualidade da regeneração do tecido muscular esquelético, após injúria causado pelo envenenamento botrópico.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Papel regulatório das prostaglandinas produzidas a partir das vias COX-1 e COX-2, sobre a neovascularização durante a regeneração muscular esquelética, induzida pela injeção de veneno de serpente Bothrops asper
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022) Correia, Melissa Rodrigues [UNIFESP]; Moreira, Vanessa [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1310560200014128; http://lattes.cnpq.br/5681640347095648
    Um evento essencial no reparo do tecido muscular esquelético após injúria, é o restabelecimento da microcirculação local, importante no suprimento de oxigênio e nutrientes, e remoção de metabólitos e debris celulares. Apesar do conhecimento da regulação dos mediadores pró-inflamatórios sobre o processo de angiogênese, pouco se conhece a influência dos mediadores derivados do ácido araquidônico, como as prostaglandinas (PGs) produzidas pelas vias das ciclooxigenases (COX)-1 e -2. O uso de venenos de serpentes do gênero Bothrops constitui um modelo complexo para estudos de regeneração muscular, pois contêm toxinas que, além de inflamação e miotoxicidade local, comprometem a estrutura de vasos sanguíneos, afetando a qualidade do reparo tecidual. O objetivo do trabalho foi avaliar a influência das prostaglandinas das vias COX-1 e- 2 sobre a neovascularização do tecido muscular esquelético, após injúria induzida pelo veneno de Bothrops asper. Para tanto, grupos distintos de camundongos Swiss machos (CEUA 9047230920) receberam VBa i.m. (2.5 mg/kg/50μL) no músculo gastrocnêmio direito ou solução salina (SS) no músculo contralateral (controle). Após 30 min, 2 e 6 dias foram tratados por via oral com lumiracoxibe (LUM/inibidor seletivo de COX-2/20mg/kg), indometacina (IND/inibidor não seletivo de COXs-/5 mg/kg) ou solução veículo (TW/Tween 1%). Após 24 h, 7 e 21 dias (d), os músculos foram coletados e analisados quanto ao grau de hemorragia (sol. Drabkin), isquemia (laser doppler), produção de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e de metaloproteinases de matriz (MMPs) (ELISA), bem como expressão proteica de CD31 e COX-2 (western blotting). Na fase degenerativa (24h), os camundongos tratados com VBa/IND e VBa/LUM apresentaram diminuição significativa (p<0,05) do fluxo sanguíneo (39±4 e 43±2%, respectivamente) quando comparados ao VBa/TW (58±3%). Na fase regenerativa (21d) animais VBa/IND e VBa/LUM apresentaram aumento significativo (p<0,05) no fluxo sanguíneo do membro posterior (116±7 e 110±4%, respectivamente) em comparação aos camundongos VBa/TW (94±6%). Em 24h, camundongos VBa/IND apresentaram teor significativo de hemoglobina tecidual (22±2 mg/g), quando comparados aos animais VBa/TW (17±1 mg/g). No início da regeneração (7d), animais VBa/IND (424±42, 733±70 e 3247±150 ng/mL/mg, respectivamente) e VBa/LUM (427±10, 676±109 e 2919±256 ng/mL/mg, respectivamente) apresentaram diminuição significativa (p<0,05) nas concentrações de MMP-9, -10 e -13 quando comparados aos animais VBa/TW (588±46, 1172±98 e 4596±427 ng/mL/mg, respectivamente). Nesta fase (7d), animais VBa/IND (19±3 pg/mL/mg) apresentaram aumento significativo (p<0,05) na produção de VEGF, comparados ao grupo VBa/TW (12±1 pg/mL/mg). Já em 21d, animais VBa/LUM e VBa/IND apresentaram aumento significativo (p<0,05) nos níveis de VEGF (12±1 e 12±2 pg/mL/mg, respectivamente), em comparação ao grupo VBa/TW (6±0.03 pg/mL/mg). De outra parte, na fase degenerativa (24h) animais VBa/TW apresentaram diminuição significativa (p<0,05) na expressão de COX-2 e CD31, em comparação ao controle (SS/TW), enquanto os tratados com VBa/LUM e VBa/IND apresentaram expressão de COX-2 e CD31 igual aos respectivos grupos SS/TW. No início da regeneração (7 d) animais tratados com VBa/IND apresentaram diminuição significativa (p<0,05) de COX-2, comparados aos VBa/TW. Por outro lado, animais tratados com VBa/LUM, apresentaram aumento significativo (p<0,05) da expressão CD31, quando comparados aos respectivos animais VBa/TW. No período mais avançado da regeneração (21d) os animais VBa/LUM e VBa/IND, apresentaram aumento significativo de CD31 (p<0,05), quando comparado aos animais VBa/TW. Os resultados indicam que as prostaglandinas das vias das ciclooxigenases, especialmente a COX-2, estimulam mecanismos que preservam a lesão vascular causada pelo VBa, e são responsáveis pela regulação dos fatores angiogênicos como MMP-9,-10 e -13 e VEGF durante a regeneração tecidual. Ainda, a inibição da produção destes mediadores no início da regeneração desencadeia mecanismos supra regulatórios que aceleram o processo de angiogênese neste modelo.