Aplicações da bioengenharia tecidual e do potencial anti-inflamatório e pró-angiogênico da proteína anexina A1 em heteroenxertos de pele acelular
Data
2016-03-30
Autores
Mimura, Kallyne Kioko Oliveira 
Orientadores
Oliani, Sonia Maria
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
The development of skin substitutes is essential to overcome the shortage at organs transplantation. Furthermore, the use of drugs to modulate the inflammation and angiogenesis processes is important to the successful tissue regeneration. Objectives: The aims of our investigations were to standardize techniques of porcine skin decellularization, to develop acellular skins matrix (scaffolds) without cross-linking, to evaluate its biocompatibility and the anti-inflammatory / pro-angiogenic potential of the AnxA12-26 peptide of the annexin A1 protein in heterologous transplants. Materials and methods: Scaffolds (1 and 2), produced without cross-linking by two types of decellularization protocols (osmotic shock and enzymatic digestion), were evaluated by histological, molecular and biomechanical methods. For the biocompatibility analysis, the scaffolds and Permacol? as control (commercially available porcine dermal scaffold with crosslinking) were implanted in rats (Rattus norvegicus) for 3, 14, 21 and 90 days. The peripheral blood was collected for leukocytes quantification and plasma was isolated for the pro-inflammatory cytokines IL-6, TNF-? and IL-1? measurement. The implants and the surrounding tissues were processed for histological, immuno-histochemical (blood vessels, myofibroblasts, IL-6 positive cells and ED-1 / CCR7 / CD163 positive macrophages) and molecular (IL-1?, VEGF-A, TGF-?1, COL3A1, COL1A1 and COL1A2) analysis. In the following experiments, the scaffold 1, that presented the best biological properties, was used for transplantation in Balb/c mice, treated or not i.p. with 4 mg/kg AnxA12-26 peptide, for 3, 10, 15 and 60 days. The leukocytes were quantified on peripheral blood. The transplanted scaffolds and adjacent tissue were processed for histological, biochemical (cytokines and growth factors measurement) and molecular (VEGF-A, FGF-b, TGF-?1 and ?-SMA) analysis. Results: The decellularization methods were effective in both scaffolds (1 and 2), with preservation of extracellular matrix components (collagen and glycosaminoglycans) and adequate tensile strength at biomechanical testing. Initially, on 3rd day post-implantation, polymorphonuclear cells were observed inside scaffolds and were gradually replaced by IL-6 positive cells and M1 macrophages, at the 14th day. After 21 days, M2 macrophages, myofibroblasts and blood vessels were observed inside the scaffold. The cellular events observed in heterograft were consistent with the gene expression of investigated trophic factors, which were involved in tissue remodeling (IL-1?, TGF- ?1, VEGF-A, COL1A1, COL1A2 and COL3A1). The peptide AnxA12-26 administration in heterologous transplants was effective, promoting the reduction of proinflammatory mediators (IL-1?, IL-6, TNF-?, IL-17 and IFN-?) and increasing of cellular infiltration, pro-angiogenic factors expression (VEGF-A, b-FGF and TGF-?1) and myofibroblasts recruitment. Conclusion: Together, our results show the efficiency of the two decellularization protocols, indicating that both scaffolds are biologically compatible, allowing the cells recruitment and tissue remodeling with the gradual replacement of the acellular matrix. Moreover, our data reveals an important role of the AnxA1 protein in angiogenic and inflammatory processes on the experimental model of acellular skin heterologous transplants.
O desenvolvimento de substitutos de pele é essencial para superar a escassez de órgãos para transplante. Além disso, o uso de fármacos, capazes de modular os processos de inflamação e angiogênese, é de grande importância para o sucesso da regeneração tecidual. Objetivos: Padronizar técnicas de descelularização de pele suína, desenvolver matrizes de peles acelulares (scaffolds) sem cross-linking, avaliar a biocompatibilidade dos scaffolds e o potencial antiinflamatório/ pró-angiogênico do peptídeo AnxA12-26 da proteína anexina A1 em transplantes heterólogos. Materais e Métodos: Scaffolds (1 e 2), confeccionados sem cross-linking por dois tipos de protocolos de descelularização (digestão enzimática e choque osmótico), foram avaliados histológica, biomecânica e molecularmente. Para análise da biocompatibilidade, os scaffolds e o controle Permacol? (scaffold de derme suína com cross-linking e comercialmente disponível) foram implantados em ratos (Rattus novergicus) por 3, 14, 21 e 90 dias. O sangue periférico foi coletado para quantificação dos leucócitos e o plasma isolado para dosagem das citocinas pró-inflamatórias IL-6, TNF-? e IL-1?. Os implantes e tecidos adjacentes foram processados para as análises histopatológicas, imunohistoquímicas (vasos sanguíneos, miofibroblastos, células IL-6 positivas e macrófagos ED-1 / CCR7 / CD163) e moleculares (IL-1?, VEGF-A, TGF- ?1, COL3A1, COL1A1 e COL1A2). Nos experimentos seguintes, o scaffold 1, por apresentar melhores propriedades biológicas, foi usado para os transplantes em camundongos Balb/c sem e com tratamento com o peptídeo AnxA12-26 , 4 mg/kg, ip., nos períodos de 3, 10, 15 e 60 dias. No sangue periférico foi quantificado os leucócitos. Os scaffolds transplantados e tecidos adjacentes foram processados para análises histopatológicas, bioquímicas (dosagem de citocinas e fatores de crescimento) e moleculares (VEGF-A, FGFb, TGF- ?1 e ?-SMA). Resultados: Os métodos de descelularização foram efetivos em ambos os scaffolds (1 e 2), com preservação da matriz extracelular (glicosaminoglicanos e colágeno) e adequada resistência à tração pelos testes biomecânicos. Inicialmente, no 3° dia pós-implante, foi observado células polimorfonucleares junto aos scaffolds que, gradualmente foram substituídas, a partir do 14° dia, por células IL-6 positivas e macrófagos-M1. Após 21 dias, macrófagos-M2, miofibroblastos e vasos sanguíneos foram observados no interior dos scaffolds. Os eventos celulares observados no heteroenxerto de pele foram congruentes com a expressão gênica de fatores tróficos investigados e envolvidos na remodelação tecidual (IL-1?, TGF-?1, VEGF-A, COL1A1, COL1A2 e COL3A1). A administração do peptídeo AnxA12-26 nos transplantes heterólogos foi efetiva, pois diminuiu os mediadores pró-inflamatórios (IL-1?, IL-6, TNF-?, IL-17 e IFN-?) e aumentou a infiltração celular, os fatores próangiogênicos (VEGF-A, FGF-b e TGF-?1) e os miofibroblastos. Conclusão: Em conjunto, nossos resultados mostram a eficiência dos dois protocolos de descelularização, indicando que ambos scaffolds são biologicamente compatíveis, permitindo o recrutamento de células e a remodelação tecidual pela substituição gradual da matriz acelular. Ainda, nossos dados foram inovadores em relação ao papel da proteína AnxA1 no entendimento dos processos angiogênicos e inflamatórios no modelo experimental de transplantes heterólogos de peles acelulares.
O desenvolvimento de substitutos de pele é essencial para superar a escassez de órgãos para transplante. Além disso, o uso de fármacos, capazes de modular os processos de inflamação e angiogênese, é de grande importância para o sucesso da regeneração tecidual. Objetivos: Padronizar técnicas de descelularização de pele suína, desenvolver matrizes de peles acelulares (scaffolds) sem cross-linking, avaliar a biocompatibilidade dos scaffolds e o potencial antiinflamatório/ pró-angiogênico do peptídeo AnxA12-26 da proteína anexina A1 em transplantes heterólogos. Materais e Métodos: Scaffolds (1 e 2), confeccionados sem cross-linking por dois tipos de protocolos de descelularização (digestão enzimática e choque osmótico), foram avaliados histológica, biomecânica e molecularmente. Para análise da biocompatibilidade, os scaffolds e o controle Permacol? (scaffold de derme suína com cross-linking e comercialmente disponível) foram implantados em ratos (Rattus novergicus) por 3, 14, 21 e 90 dias. O sangue periférico foi coletado para quantificação dos leucócitos e o plasma isolado para dosagem das citocinas pró-inflamatórias IL-6, TNF-? e IL-1?. Os implantes e tecidos adjacentes foram processados para as análises histopatológicas, imunohistoquímicas (vasos sanguíneos, miofibroblastos, células IL-6 positivas e macrófagos ED-1 / CCR7 / CD163) e moleculares (IL-1?, VEGF-A, TGF- ?1, COL3A1, COL1A1 e COL1A2). Nos experimentos seguintes, o scaffold 1, por apresentar melhores propriedades biológicas, foi usado para os transplantes em camundongos Balb/c sem e com tratamento com o peptídeo AnxA12-26 , 4 mg/kg, ip., nos períodos de 3, 10, 15 e 60 dias. No sangue periférico foi quantificado os leucócitos. Os scaffolds transplantados e tecidos adjacentes foram processados para análises histopatológicas, bioquímicas (dosagem de citocinas e fatores de crescimento) e moleculares (VEGF-A, FGFb, TGF- ?1 e ?-SMA). Resultados: Os métodos de descelularização foram efetivos em ambos os scaffolds (1 e 2), com preservação da matriz extracelular (glicosaminoglicanos e colágeno) e adequada resistência à tração pelos testes biomecânicos. Inicialmente, no 3° dia pós-implante, foi observado células polimorfonucleares junto aos scaffolds que, gradualmente foram substituídas, a partir do 14° dia, por células IL-6 positivas e macrófagos-M1. Após 21 dias, macrófagos-M2, miofibroblastos e vasos sanguíneos foram observados no interior dos scaffolds. Os eventos celulares observados no heteroenxerto de pele foram congruentes com a expressão gênica de fatores tróficos investigados e envolvidos na remodelação tecidual (IL-1?, TGF-?1, VEGF-A, COL1A1, COL1A2 e COL3A1). A administração do peptídeo AnxA12-26 nos transplantes heterólogos foi efetiva, pois diminuiu os mediadores pró-inflamatórios (IL-1?, IL-6, TNF-?, IL-17 e IFN-?) e aumentou a infiltração celular, os fatores próangiogênicos (VEGF-A, FGF-b e TGF-?1) e os miofibroblastos. Conclusão: Em conjunto, nossos resultados mostram a eficiência dos dois protocolos de descelularização, indicando que ambos scaffolds são biologicamente compatíveis, permitindo o recrutamento de células e a remodelação tecidual pela substituição gradual da matriz acelular. Ainda, nossos dados foram inovadores em relação ao papel da proteína AnxA1 no entendimento dos processos angiogênicos e inflamatórios no modelo experimental de transplantes heterólogos de peles acelulares.
Descrição
Citação
MIMURA, Kallyne Kioko. Aplicações da bioengenharia tecidual e do potencial anti-inflamatório e pró-angiogênico da proteína anexina A1 em heteroenxertos de pele acelular. 2016. 190 f. Tese (Doutorado em Biologia Estrutural e Funcional) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2016.