Caracterização funcional do ativador de fator X purificado do extrato bruto das cerdas de Lonomia oblíqua: ação sobre células endoteliais (HUVECs) e clonagem
Data
2006
Autores
Alvarez Flores, Miryam Paola 
Orientadores
Tavassi, Ana Marisa Chudzinski
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
O contato acidental com as cerdas da lagarta Lonomia obliqua pode provocar uma severa hemorragia. Em estudos prévios, nosso grupo reportou a presença de ativadores de protrombina e de fator X no extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua. Neste estudo, descrevemos a purificação de um ativado r de fator X de 45 kDa a partir das cerdas da L. obliqua utilizando cromatografias de troca iônica (DEAE-Sephadex A-50) e gel filtração (TSK Gel2000 SW, sistema HPLC). A proteína purificada foi denominada Losac. O Losac foi capaz de ativar o fator X de maneira dose-dependente em ensaios utilizando o substrato cromogênico S-2765. Esta ativação foi independente de íons cálcio, a diferença dos ativadores isolados de venenos de serpentes. Losac não ativa protrombina. Os fragmentos de fator X humano clivado pelo Losac foram comparados com os fragmentos gerados pelo RVV-X, e os resultados mostraram bandas correspondentes ao fator Xa. A atividade ativadora de fator X do Losac foi inibida por 20 mM de PMSF e que foi analisado por SDS-PAGE. Estes resultados sugerem que o Losac atua similar a uma serinoprotease. Utilizando o peptídeo fluorogênico Abz-NNLTRIVGGQ-EDDnp, cuja seqüência foi baseada na seqüência de ativação do fator X, foram obtidos os produtos da clivagem pelo Losac e analisados por Q¬I I TOF, confirmando que a clivagem ocorreu entre a ligação peptídica Arg52-11e53, a mesma ligação peptídica clivada pelos ativadores fisiológicos da coagulação e pelo RVV-X. As características do Losac mostram que se trata de uma serinoprotease de uma cadeia, sendo o primeiro ativador de fator X isolado de um lepidóptero e que poderia ter um papel importante nos envenenamentos. Em culturas de HUVECs, Losac foi capaz de incrementar a proliferação celular, e inibir a apoptose induzida por falta de nutrientes. HUVECs incubadas com o Losac (0,58 IJM for 1 h) incrementou a liberação de óxido nítrico e do ativado r de plasminogênio tis sul ar (t-PA), ambas as moléculas conhecidas por mediar mecanismos de antiapoptose. Losac também incrementou, mas de forma não significativa, o DAF (decqy-acceleratingfactor = CD55), que protege as células da lise mediada pelo complemento. Por outro lado, o Losac não alterou a liberação ou expressão do fator de von Willebrand (FvW), do fator tissular (FT), do ICAM-l (intercellular adhesion molecule-l), da intedeucina 8 (IL-8), e da prostaciclina 12 (pGlz). Estas características indicam que o Losac, uma proteína com atividade procoagulante, também funciona como um estimulador do crescimento celular e um inibidor da morte celular em células endoteliais. Além disso, os ensaios de viabilidade celular por MTT revelaram que esta...(au).
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2006. 177 p.