Papel dos glicosaminoglicanos da família da heparina na indução e estabilização de fibras β-amilóides derivadas da enzima proteolítica HTRA1
| dc.contributor.advisor | Tersariol, Ivarne Luis dos Santos [UNIFESP] | |
| dc.contributor.advisor-co | Lima, Marcelo Andrade | |
| dc.contributor.advisor-coLattes | http://lattes.cnpq.br/2373620610058306 | pt_BR |
| dc.contributor.advisorLattes | http://lattes.cnpq.br/4859954582615304 | pt_BR |
| dc.contributor.author | Braga, Luiz Fernando Patekoski [UNIFESP] | |
| dc.contributor.authorLattes | http://lattes.cnpq.br/1997933486455894 | pt_BR |
| dc.coverage.spatial | São Paulo | pt_BR |
| dc.date.accessioned | 2023-11-27T18:41:54Z | |
| dc.date.available | 2023-11-27T18:41:54Z | |
| dc.date.issued | 2023-09-13 | |
| dc.description.abstract | [Introdução] A serinoprotease HTRA1 é um homotrímero formada por três cadeias polipeptídicas idênticas, essa enzima é capaz de degradar várias proteínas da matriz extracelular, tais como a fibronectina, os proteoglicanos agrecam, decorim, fibromodulina, bem como, regular a disponibilidade dos fatores de crescimento da família dos FGF, IGF e TGF-β, para a sinalização celular. Essa protease está envolvida em várias neuropatias, como na degeneração macular associada a idade (ARMD7), na distrofia corneana, em neuropatias hereditárias cerebrovasculares (CARASIL e CADASIL) e Alzheimer. Dentre os diversos glicosaminoglicanos (GAGs), a heparina é um potente indutor da formação de fibras β-amilóides em várias proteínas [Objetivos]. Os principais objetivos deste trabalho foram trabalho verificar a capacidade da enzima HTRA1 de se polimerizar e fibras β-amilóides, bem como, a capacidade dos GAGs, em especial da heparina, de interagir com a enzima HTRA1 e promover a indução e a estabilização aa polimerização da enzima HTRA1 recombinante. [Métodos] dessa forma, clonamos e expressamos em E. coli três isoformas recombinantes da enzima HTRA1: a enzima selvagem, a enzima inativa, mutante de sítio ativo S328A e a enzima defectiva do domínio PDZ (ΔPDZ). Verificamos por diferentes técnicas biofísicas e bioquímicas o impacto da interação molecular da heparina e de outros GAGs na estrutura tridimensional e na atividade catalítica da enzima HTRA1. A atividade catalítica das formas recombinantes da enzima HTRA1 foram monitoradas por espectrofluorimetria com o auxílio do substrato fluorescente do tipo FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), MCA-IRRVSYSF(K-Dnp)K. A polimerização dos monômeros da enzima HTRA1, bem como, a polimerização induzida por GAGs foi monitorada por DLS (Dynamic Light Scattering), SDS-PAGE, espectrofluorimetria, espectrometria de massa, coloração com Congo Red e por microscopia eletrônica de varredura. [Resultados] A heparina se mostrou um potente inibidor da atividade proteolítica da HTRA1, a heparina interage com maior afinidade na enzima livre (Ki = 85 ± 9 nM) do que no complexo enzima-substrato (αKi = 246 ± 34 nM); porém a ligação da heparina na enzima livre impede a ligação do substrato no sítio ativo. Esses resultados indicam que a heparina é um inibidor do tipo misto. Os nossos resultados também mostraram que o domínio PDZ controla alostericamente a ligação da heparina. A heparina interage tanto com o domínio catalítico da enzima HTRA1, bem como com seu domínio PDZ. A interação da heparina com o domínio PDZ da HTRA1 é capaz de estabilizar a forma homotrimérica da enzima, além de induzir a sua polimerização e a formação de fibras β-amilóides nessa proteína. Também foi observado por espectroscopia de CD e por espectrofluorimetria intrínseca que a heparina é capaz de promover alterações conformacionais na enzima HTRA1, induzindo tanto a formação de estruturas β-antiparalelas quanto a formação de fibras β-amilóides. Dentre os diversos GAGs estudados, nominalmente: heparina, condroitim-4 e 6-sulfato, dermatam-sulfato e ácido hialurônico, somente a o ácido hialurônico não foi capaz de induzir a formação de agregados amiloidogênicos na enzima HTRA1, essa indução é dependente da organização espacial das cargas negativas dos grupamentos sulfatos e carboxílicos desses polissacarídeos. A capacidade de indução dos agregados amilóides pela heparina é dependente do domínio PDZ da enzima, bem como, não depende da capacidade proteolítica da HTRA1, nem da capacidade inibitória da heparina. Observamos, também, que a formação de agregados proteicos da HTRA1 é dependente da força iônica do meio (≤ 160 mM) e da concentração da HTRA1 em solução. A enzima HTRA1 se autopolimeriza em concentrações ≥ 2.0 µM (pH 7.4) em força iônica = 0,15 M. Os dados obtidos por Microscopia Eletrônica de Varredura mostraram que a heparina induz a formação de estruturas fibrilares a partir de agregados esferoides de 40 nm. Os ensaios de espectroscopia UV-Vis da interação da HTRA1 com o corante Congo Red mostraram que os agregados de HTRA1 observados pela técnica de DLS são, de fato, fibras β-amilóides. [Conclusão]. A heparina é um potente inibidor da atividade proteolítica da HTRA1 (KI = 85 ± 9 nM). A HTRA1 é capaz de autopolimeriza, espontaneamente, formando fibras β-amilóides, em concentrações ≥ 2 µM em pH e força iônica fisiológicos. Os GAGs da família da heparina induzem e estabilizam essa polimerização. Esses resultados podem ser translacionados para as doenças neurológicas hereditárias ou adquiridas onde a enzima HTRA1 está sabidamente envolvida, na degeneração macular associada a idade (ARMD7), na distrofia corneana, em neuropatias hereditárias cerebrovasculares (CARASIL e CADASIL) e Alzheimer. | pt_BR |
| dc.description.abstract | [Introduction] The HTRA1 serine protease is a homotrimer formed by three identical polypeptide chains, this enzyme is capable of degrading several proteins of the extracellular matrix, such as fibronectin, proteoglycans aggrecan, decorin, fibromodulin, as well as regulating the availability of stress factors. growth of the FGF family, IGF and TGF-β, for cell signaling. This protease is involved in several neuropathies, such as age-associated macular degeneration (ARMD7), corneal dystrophy, hereditary cerebrovascular neuropathies (CARASIL and CADASIL) and Alzheimer’s. Among the various glycosaminoglycans (GAGs), heparin is a potent inducer of the formation of β-amyloid fibers in several proteins [Objectives]. The main objectives of this work were to verify the ability of the HTRA1 enzyme to polymerize in β-amyloid fibers, as well as the ability of GAGs, especially heparin, to interact with the HTRA1 enzyme and promote the induction and stabilization of polymerization of the recombinant HTRA1 enzyme. [Methods] Therefore, we cloned and expressed in E. coli three recombinant isoforms of the HTRA1 enzyme: the wild-type enzyme, the inactive enzyme, active site mutant S328A, and the PDZ domain-defective enzyme (ΔPDZ). We verified, using different biophysical and biochemical techniques, the impact of the molecular interaction of heparin and other GAGs on the three- dimensional structure and catalytic activity of the HTRA1 enzyme. The catalytic activity of the recombinant forms of the HTRA1 enzyme was monitored by spectrofluorimetric with the aid of a FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) fluorescent substrate, MCA-IRRVSYSF(K-Dnp)K. The polymerization of HTRA1 enzyme monomers, as well as the polymerization induced by GAGs, was monitored by DLS (Dynamic Light Scattering), SDS-PAGE, spectrofluorimetry, mass spectrometry, Congo Red staining and scanning electron microscopy. [Results and Discussion] Heparin proved to be a potent inhibitor of the proteolytic activity of HTRA1, heparin interacts with greater affinity in the free enzyme (Ki = 85 ± 9 nM) than in the enzyme- substrate complex (αKi = 246 ± 34 nM); however, binding of heparin to the free enzyme prevents substrate binding to the active site. These results indicate that heparin is a mixed-type inhibitor. Our results also showed that the PDZ domain allosterically controls heparin binding. Heparin interacts with both the catalytic domain of the HTRA1 enzyme as well as its PDZ domain. The interaction of heparin with the PDZ domain of HTRA1 is capable of stabilizing the homotrimeric form of the enzyme, in addition to inducing its polymerization and the formation of β-amyloid fibers in this protein. It was also observed by CD spectroscopy and intrinsic spectrofluorimetry that heparin is able to promote conformational changes in the HTRA1 enzyme, inducing both the formation of β-antiparallel structures and the formation of β-amyloid fibers. Among the various GAGs studied, namely: heparin, chondroitin-4 and 6-sulfate, dermatan-sulfate and hyaluronic acid, only hyaluronic acid was not able to induce the formation of amyloidogenic aggregates in the HTRA1 enzyme, this induction is dependent on the spatial organization of the negative charges of the sulfate and carboxylic groups of these polysaccharides. The ability to induce amyloid aggregates by heparin is dependent on the PDZ domain of the enzyme, as well as it does not depend on the proteolytic capacity of HTRA1, nor on the inhibitory capacity of heparin. We also observed that the formation of HTRA1 protein aggregates is dependent on the ionic strength of the medium (≤ 160 mM) and on the concentration of HTRA1 in solution. The HTRA1 self-polymerizes at concentrations ≥ 2.0 μM (pH 7.4) at ionic-strength = 0.15 M. Data obtained by Scanning Electron Microscopy showed that heparin induces the formation of fibrillar structures from 40 nm spheroid aggregates. The UV-Vis spectroscopy assays of the interaction of HTRA1 with the Congo Red dye showed that the HTRA1 aggregates observed by the DLS technique are, in fact, β-amyloid fibers. [Conclusion]. Heparin is a potent inhibitor of the proteolytic activity of HTRA1 (KI = 85 ± 9 nM). HTRA1 is able to spontaneously self-polymerize, forming β-amyloid fibers at concentrations ≥ 2 μM at physiological pH and ionic strength. GAGs from the heparin family induce and stabilize this polymerization. These results can be translated to hereditary or acquired neurological diseases where the HTRA1 enzyme is known to be involved, in age-associated macular degeneration (ARMD7), in corneal dystrophy, in hereditary cerebrovascular neuropathies (CARASIL and CADASIL) and Alzheimer. | en |
| dc.description.sponsorship | Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) | pt_BR |
| dc.description.sponsorship | Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) | |
| dc.description.sponsorship | Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) | |
| dc.description.sponsorshipID | 140969/2018-7 | pt_BR |
| dc.emailadvisor.custom | ivarne.tersariol@unifesp.br | pt_BR |
| dc.format.extent | 161 f. | pt_BR |
| dc.identifier.citation | BRAGA, Luiz Fernando Patekoski. Papel dos glicosaminoglicanos da família da heparina na indução e estabilização de fibras β-amilóides derivadas da enzima proteolítica HTRA1. 2023. 161 f. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) - Escola Paulista de Medicina, Univesidade Federal de São Paulo (UNIFESP). São Paulo, 2023. | pt_BR |
| dc.identifier.uri | https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/69546 | |
| dc.language | por | pt_BR |
| dc.publisher | Universidade Federal de São Paulo | pt_BR |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | pt_BR |
| dc.subject | HTRA1 | pt_BR |
| dc.subject | Polimerização | pt_BR |
| dc.subject | Fibras β-amilóides | pt_BR |
| dc.subject | Amiloidose | pt_BR |
| dc.subject | Heparina | pt_BR |
| dc.subject | Glicosaminoglicanos | pt_BR |
| dc.subject | Fibras beta-amilóides | pt_BR |
| dc.title | Papel dos glicosaminoglicanos da família da heparina na indução e estabilização de fibras β-amilóides derivadas da enzima proteolítica HTRA1 | pt_BR |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | pt_BR |
| unifesp.campus | Escola Paulista de Medicina (EPM) | pt_BR |
| unifesp.graduateProgram | Ciências Biológicas (Biologia Molecular) | pt_BR |
| unifesp.knowledgeArea | Biologia Molecular | pt_BR |