Construção De Biblioteca De Inibidores Proteicos Em Sistema Phage Display Para Seleção De Inibidores Específicos Para Proteases De Larvas De Mosquito Aedes Aegypti
Data
2017-10-26
Autores
Manzato, Veronica De Moraes 
Orientadores
Tanaka, Aparecida Sadae
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
The mosquito Aedes aegypti is well adapted to urban environment and the major vector of several diseases as dengue, yellow fever, zika and chikungunya flaviviruses. It has been considered a global public health problem because, in the last years, the outbreaks of every 3-5 years of dengue have spread with increased virulence. There is no treatment for these diseases and vaccine has low efficacy, as a result, the prophylaxis remains on vector control but the presence of resistant strains of inseticides and larvicidal in use makes the control a difficult and still unsolved problem. Knowing that the larval stage feeds constantly, we intend to interfere with the larvae development by the inhibition of the digestion proteins. A neutrophil elastase and chymotrypsin inhibitor found in Triatoma infestans eggs named TiPI (Triatoma infestans Pacifastin Inhibitor) had the reactive site (P2-P2’) randomly mutated by the phage display technique which allowed their selection against digestive enzymes of the 4th instar larvae midgut. The selected mutants DNA analyzes evidenced group of 11% possible trypsin inhibitors with Arg or Lys at P1 position, 18.5% possible neutrophil elastase inhibitors with Ala, Leu or Val at P1 and curiously, the major group represented by 47% of the mutants with Gln at P1 and 88.8% with Gln at any mutated position. Fusion phages of ten selected mutants were produced, among them 4 possible trypsin inhibitor, mutants 73 (QRLQ), 154 (LKQL), 161 (KRKQ) and 189 (QRHL), 2 possible chymotrypsin inhibitor 29 (ALAR) and 143 (LLQC), and the 4 most frequently mutants, 4 (SQWH), 5 (QSAM), 6 (HQSL) and 22 (AQVF) and their interactions with proteins of the 4th instar larvae midgut and commercial enzymes were evaluated by Surface Plasmon Resonance. The inconclusive results conduct us to protein expression by Pichia pastoris yeast. The yeast supernatant culture containing recombinant mutants was used in the serine 18 protease inhibition assays. Among the trypsin inhibitors, mutant 73.21 showed high inhibitory activity to trypsin, and the mutant 29.14 inhibits neutrophil elastase. Mutants 4.27, 5.26 and 6.27 presented inhibitory activity for subtilisin A. The results confirm that the TiPI1 phage display library allowed the selection of specific mutants against digestive enzymes of larvae of Ae. aegypti. Our results suggested that these molecules can be use in the development of specific synthetic inhibitors with larvicidal activity for Ae. aegypti.
O mosquito Aedes aegypti é vetor de arboviroses como febre amarela, dengue, zika, chikungunya e está adaptado ao ambiente urbano. Considerado problema de saúde pública mundial, os surtos de dengue costumam ter ciclos a cada 3-5 anos, com aumento de virulência e expansão a cada ciclo. Como não há tratamento, a profilaxia inclui vacinação, porém, a vacina contra a dengue apresenta baixa eficácia, portanto o controle da doença é feito principalmente pelo controle do vetor, o mosquito Ae. aegypti. Até o momento não existe um método eficiente de controle do mosquito, o que se agrava com a presença de linhagens resistentes aos inseticidas e larvicidas. Sabendo que a larva se alimenta constantemente, pretendemos interferir no desenvolvimento da larva por meio da inibição da digestão de proteínas. Neste trabalho, utilizamos a técnica de phage display e um inibidor de elastase de neutófilos e quimotripsina presente em ovos de Triatoma infestans denominado TiPI (Triatoma infestans Pacifastin Inhibitor) mutados na região do sítio reativo (P2-P2’) randomicamente. As proteínas mutadas expostas em sua conformação ativa na superfície do fago foram selecionadas em extrato de intestino de larva 4° instar de Ae. aegypti. A análise das sequências de DNA dos clones selecionados evidenciou um grupo de 11% de clones possíveis inibidores de tripsina com Arg ou Lys em P1, 18,5% de clones possíveis inibidores de elastase com Ala, Leu ou Val em P1 e curiosamente, o maior grupo representado por 47%, de clones com Gln em P1 e 88,8% com Gln em qualquer posição da região mutada. Dez clones foram selecionados para a produção de fagos de fusão, sendo 4 possíveis inibidores de tripsina, clone 73 (QRLQ), clone 154 (LKQL), clone 161 (KRKQ) e clone 189 (QRHL), 2 clones inibidores de quimotripsina, clone 29 (ALAR) e clone 143 (LLQC) e os 4 clones mais frequentes, clone 4 (SQWH), clone 5 (QSAM), clone 16 6 (HQSL) e clone 22 (AQVF) os quais foram avaliados sobre proteínas do extrato de intestino de larva de Ae. aegypti e enzimas comerciais pelo método de ressonância plasmônica de superfície. Devido aos dados inconclusivos, os mesmos foram expressos em sistema de levedura Pichia pastoris. O sobrenadante de cultura de levedura contendo as proteínas recombinantes foram avaliados quanto à sua atividade inibitória. Dentre os inibidores de tripsina, o clone 73.21 apresentou a melhor atividade inibitória para tripsina, enquanto o clone 29.14 se destacou na inibição para elastase de neutrófilos. Os clones 4.27, 5.26 e 6.27 apresentaram atividade inibitória para subtilisina A. Os resultados obtidos neste trabalho confirmam que a biblioteca de mutantes em fagos filamentosos e a seleção para enzimas digestivas de larvas de Ae. aegypti permitiram a obtenção de inibidores para estas enzimas. Estes dados iniciais são promissores e a melhor caracterização dessas moléculas é essencial para que sejam utilizadas no desenvolvimento de inibidores sintéticos e específicos com ação larvicida, para o controle do vetor.
O mosquito Aedes aegypti é vetor de arboviroses como febre amarela, dengue, zika, chikungunya e está adaptado ao ambiente urbano. Considerado problema de saúde pública mundial, os surtos de dengue costumam ter ciclos a cada 3-5 anos, com aumento de virulência e expansão a cada ciclo. Como não há tratamento, a profilaxia inclui vacinação, porém, a vacina contra a dengue apresenta baixa eficácia, portanto o controle da doença é feito principalmente pelo controle do vetor, o mosquito Ae. aegypti. Até o momento não existe um método eficiente de controle do mosquito, o que se agrava com a presença de linhagens resistentes aos inseticidas e larvicidas. Sabendo que a larva se alimenta constantemente, pretendemos interferir no desenvolvimento da larva por meio da inibição da digestão de proteínas. Neste trabalho, utilizamos a técnica de phage display e um inibidor de elastase de neutófilos e quimotripsina presente em ovos de Triatoma infestans denominado TiPI (Triatoma infestans Pacifastin Inhibitor) mutados na região do sítio reativo (P2-P2’) randomicamente. As proteínas mutadas expostas em sua conformação ativa na superfície do fago foram selecionadas em extrato de intestino de larva 4° instar de Ae. aegypti. A análise das sequências de DNA dos clones selecionados evidenciou um grupo de 11% de clones possíveis inibidores de tripsina com Arg ou Lys em P1, 18,5% de clones possíveis inibidores de elastase com Ala, Leu ou Val em P1 e curiosamente, o maior grupo representado por 47%, de clones com Gln em P1 e 88,8% com Gln em qualquer posição da região mutada. Dez clones foram selecionados para a produção de fagos de fusão, sendo 4 possíveis inibidores de tripsina, clone 73 (QRLQ), clone 154 (LKQL), clone 161 (KRKQ) e clone 189 (QRHL), 2 clones inibidores de quimotripsina, clone 29 (ALAR) e clone 143 (LLQC) e os 4 clones mais frequentes, clone 4 (SQWH), clone 5 (QSAM), clone 16 6 (HQSL) e clone 22 (AQVF) os quais foram avaliados sobre proteínas do extrato de intestino de larva de Ae. aegypti e enzimas comerciais pelo método de ressonância plasmônica de superfície. Devido aos dados inconclusivos, os mesmos foram expressos em sistema de levedura Pichia pastoris. O sobrenadante de cultura de levedura contendo as proteínas recombinantes foram avaliados quanto à sua atividade inibitória. Dentre os inibidores de tripsina, o clone 73.21 apresentou a melhor atividade inibitória para tripsina, enquanto o clone 29.14 se destacou na inibição para elastase de neutrófilos. Os clones 4.27, 5.26 e 6.27 apresentaram atividade inibitória para subtilisina A. Os resultados obtidos neste trabalho confirmam que a biblioteca de mutantes em fagos filamentosos e a seleção para enzimas digestivas de larvas de Ae. aegypti permitiram a obtenção de inibidores para estas enzimas. Estes dados iniciais são promissores e a melhor caracterização dessas moléculas é essencial para que sejam utilizadas no desenvolvimento de inibidores sintéticos e específicos com ação larvicida, para o controle do vetor.