Resveratrol melhora a qualidade espermática, a fertilidade e a capacidade reprodutiva de ratos adultos com diabetes tipo1 induzido, na pré-puberdade, pela administração de estreptozotocina
Data
2020-10-05
Autores
Simas, Joana Nogueres 
Orientadores
Valdeolivas, Sandra Maria Miraglia
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Introduction: Diabetes Mellitus is characterized by a series of metabolic disorders. It is estimated that, in the coming decades, about 628.6 million individuals worldwide may develop the disease. Its pathogenesis progresses with the development of arteriosclerosis, angiopathies, nephropathies and neuropathies. Although conditions in the male reproductive system have already been described, the ultimate impact on the male reproductive outcomes cannot be neglected. Resveratrol, phytoalexin found in plants such as grapes and açai berries, is a powerful antioxidant capable of decreasing glycemic levels and several metabolic effects associated with diabetes mellitus. In previous studies, we observed that chronic treatment with resveratrol improves not only glycemic levels, but also plasmatic levels of testosterone, estradiol and LH, as well as quantitative sperm parameters and sperm morphology in adult animals (75 days postpartum, dpp), which had type 1 diabetes induced by streptozotocin, from prepuberty. Objectives: To investigate the protective action of resveratrol on male reproduction against the damage caused by type 1 diabetes mellitus, induced in prepuberty, with regard to future sperm quality, with an emphasis on the integrity of the DNA and the structure of the sperm chromatin and in the evaluation of the reproductive competence of the animals, when adults. Material and Methods: a hundred and twelve male Wistar rats were used, obtained by mating 15 males and 30 females, aged 12 weeks, which were used as breeders. The male rats, aged 30 days, belonging to these matings, were distributed into 7 groups: Sham control (SC; sodium citrate buffer solution); Resveratrol-vehicle control (RV-carboxymethylcellulose, resveratrol vehicle); Resveratrol (R); Diabetic (D); Diabetic-treated-with-insulin (DI); Diabetic-treated-with-resveratrol (DR); Diabetic-treated-with-insulin + resveratrol (DIR). Type 1 diabetes mellitus (DM1) was induced in animals at 30 dpp with a single intraperitoneal injection of streptozotocin (65 mg / kg). Blood glucose was monitored at 30, 33, 45, 64, 75, 100 and 110 dpp. The DR, DIR and R groups were treated, in the morning, with 150mg of resveratrol / kg of body weight / day (administered by gavage), from 33º dpp to 110º dpp. Animals of DI and DIR groups received subcutaneous injections of NPH (Neutral Protamine Hagedorn) insulin, at a dose of 1U / 100g of body weight / day, from the 5th day of diabetes induction, up to 110dpp. At 100 dpp, all animals were mated with two healthy primiparous females (n = 84) in order to evaluate fertility and gestation rates and reproductive capacity. The males were submitted to euthanasia at 110 dpp to collect the material destinated to sperm analysis and to evaluate testicular and epididymal oxidative stress levels. Qualitative sperm analysis comprised the following tests: a) Comet assay (to investigate DNA fragmentation); b) Acridine orange, to study chromatin and DNA structures and c) Chromomycin A3 (CMA3- for chromatin compaction and protamination analyses); the latter (items b and c) were evaluated using a flow cytometer. We also investigated: sperm motility (using a computerized analysis system); acrosome integrity (PNA-Arachis hypogaea lectin method); the mitochondrial mass (Mitotracker Green probe), as well aspregnancy, fertility and reproductive capacity rates. Results: DM1 significantly altered the qualitative sperm parameters and impaired xvi the fertility and pregnancy rates likewise the reproductive capacity of the animals. Consonant with other reproductive parameters previously evaluated by our group, under the same experimental conditions, the results of this research ratify the beneficial action of resveratrol on reproduction, improving sperm quality in animals with DM1, with regard to motility, mitochondrial mass and acrosomal integrity. Likewise, the administration of insulin and insulin + resveratrol also improved these parameters. The results showed that the treatment also improvemed fertility and pregnancy rates in diabetic rats treated with resveratrol and / or insulin, in relation to untreated diabetics. Conclusion: Considering the positive data regarding the normalization of glycemia in DM1, the reduction of MDA (oxidative stress marker) levels, both in the testis and in the epididymis, the improvement of the quality of sperm DNA and reproductive results in diabetic rats treated with RES, regardless of insulin therapy, we believe that RES could be considered a very promising adjuvant to control glycemic homeostasis and improve the fertility status associated with DM1, alone or in conjunction with insulin therapy.
Introdução: O Diabetes Mellitus caracteriza-se por uma série de distúrbios metabólicos. Estima-se que, nas próximas décadas, cerca de 628,6 milhões de indivíduos no mundo poderão ser acometidos pela doença. Sua patogênese cursa com o desenvolvimento de arteriosclerose, angiopatias, nefropatias e neuropatias. Afecções no sistema reprodutor masculino, embora já descritas, carecem de esclarecimentos adicionais. O resveratrol, fitoalexina encontrada em plantas como a uva e o açaí, é um poderoso antioxidante, capaz de reduzir os índices glicêmicos e atenuar diversos efeitos metabólicos indesejáveis associados ao diabetes mellitus. Em trabalho anterior, observamos que o tratamento crônico com o resveratrol promoveu a melhora não somente dos índices glicêmicos e dos níveis plasmáticos de testosterona, estradiol e de LH, bem como dos parâmetros espermáticos quantitativos e da morfologia espermática de animais adultos (75 dias pós-parto, dpp), que tiveram o diabetes tipo 1 induzido pela estreptozotocina, a partir da pré-puberdade. Objetivos: Investigar a ação protetora do resveratrol sobre a reprodução masculina, contra o dano causado pelo diabetes mellitus tipo 1, induzido na pré-puberdade, no que concerne à qualidade espermática futura, com ênfase na integridade do DNA e na estrutura da cromatina dos espermatozoides como também na avaliação da competência reprodutiva dos animais, quando adultos. Material e Métodos: Foram utilizados 112 ratos machos da linhagem Wistar, obtidos pelo acasalamento de 15 machos e 30 fêmeas, com idades de 12 semanas, utilizados como matrizes. Os ratos machos, com idade de 30 dias, provenientes destes acasalamentos, foram distribuídos em 7 grupos: Controle Sham (CS; solução tampão citrato de sódio); Controle veículo do resveratrol (VR- carboximetilcelulose, veículo do resveratrol); Resveratrol (R); Diabético (D); Diabético-tratado-com-insulina (DI); Diabético-tratado-com-resveratrol (DR); Diabético-tratado-com-insulina + resveratrol (DIR). O Diabetes mellitus tipo1 (DM1) foi induzido nos animais no 30º dpp, com uma única injeção intraperitoneal de estreptozotocina (65 mg/kg). A glicemia foi monitorada aos 30, 33, 45, 64, 75, 100 e aos 110 dpp. Os grupos DR, DIR e R foram tratados com 150mg de resveratrol/kg de peso corpóreo/dia (administrado por gavagem), matinalmente, a partir do 33º dpp até o 110º dpp. Animais dos grupos DI e DIR receberam injeções subcutâneas de insulina NPH (Neutral Protamine Hagedorn), em dose de 1U/100g de peso corpóreo/por dia, a partir do 5º dia da indução do diabetes, até o 110dpp. Aos 100 dpp, todos os animais foram acasalados cada um com duas ratas Wistar adultas (n=84) primíparas e saudáveis, para avaliação dos índices de fertilidade e de gestação e da capacidade reprodutiva. Os machos foram submetidos à eutanásia aos 110dpp, para a coleta do material destinado à realização das análises espermáticas e à avaliação do estresse oxidativo testicular e epididimário. A análise espermática qualitativa compreendeu os seguintes ensaios: a) cometa (para investigar a fragmentação do DNA); b) Laranja de Acridina (Acridine Orange), para estudo da estrutura da cromatina e do DNA) e c) Cromomicina A3 (CMA3- para análise da compactação e protaminação da cromatina); estes últimos (itens b e c) foram aquilatados utilizando-se Citômetro de Fluxo. Também foram investigados (as): a motilidade dos espermatozoides (através de sistema de análise computadorizada); a integridade acrossômica (método do PNA- xiv Arachis hypogaea lectin); a massa mitocondrial (sonda Mitotracker Green), além dos índices de gestação e de fertilidade e da capacidade reprodutiva. Resultados: DM1 alterou significantemente os parâmetros espermáticos qualitativos e prejudicou os índices de fertilidade e gestação e a capacidade reprodutiva dos animais. Em consonância com outros parâmetros reprodutivos previamente avaliados por nosso grupo, nas mesmas condições experimentais, os resultados desta pesquisa ratificam a ação benéfica do resveratrol sobre a reprodução, melhorando a qualidade espermática em animais com DM1, no que concerne à motilidade, à massa mitocondrial e à integridade acrossômica. Similarmente, as administrações só de insulina e de insulina + resveratrol também melhoraram estes parâmetros. Os resultados demonstram que o tratamento promoveu, ainda, a melhora dos índices de fertilidade e de gestação em ratos diabéticos tratados com o resveratrol e/ou com insulina, em relação aos diabéticos não tratados. Conclusão: Considerando os dados positivos em relação à normalização da glicemia no DM1, a redução dos níveis de MDA (marcador de estresse oxidativo), tanto no testículo como no epidídimo, a melhora da qualidade do DNA espermático e os resultados reprodutivos, em ratos diabéticos tratados com RES, independentemente da terapia com insulina , acreditamos que o RES poderia ser considerado um adjuvante muito promissor para controlar a homeostase glicêmica e melhorar o estado de fertilidade associado ao DM1, isoladamente ou em conjunto com insulinoterapia.
Introdução: O Diabetes Mellitus caracteriza-se por uma série de distúrbios metabólicos. Estima-se que, nas próximas décadas, cerca de 628,6 milhões de indivíduos no mundo poderão ser acometidos pela doença. Sua patogênese cursa com o desenvolvimento de arteriosclerose, angiopatias, nefropatias e neuropatias. Afecções no sistema reprodutor masculino, embora já descritas, carecem de esclarecimentos adicionais. O resveratrol, fitoalexina encontrada em plantas como a uva e o açaí, é um poderoso antioxidante, capaz de reduzir os índices glicêmicos e atenuar diversos efeitos metabólicos indesejáveis associados ao diabetes mellitus. Em trabalho anterior, observamos que o tratamento crônico com o resveratrol promoveu a melhora não somente dos índices glicêmicos e dos níveis plasmáticos de testosterona, estradiol e de LH, bem como dos parâmetros espermáticos quantitativos e da morfologia espermática de animais adultos (75 dias pós-parto, dpp), que tiveram o diabetes tipo 1 induzido pela estreptozotocina, a partir da pré-puberdade. Objetivos: Investigar a ação protetora do resveratrol sobre a reprodução masculina, contra o dano causado pelo diabetes mellitus tipo 1, induzido na pré-puberdade, no que concerne à qualidade espermática futura, com ênfase na integridade do DNA e na estrutura da cromatina dos espermatozoides como também na avaliação da competência reprodutiva dos animais, quando adultos. Material e Métodos: Foram utilizados 112 ratos machos da linhagem Wistar, obtidos pelo acasalamento de 15 machos e 30 fêmeas, com idades de 12 semanas, utilizados como matrizes. Os ratos machos, com idade de 30 dias, provenientes destes acasalamentos, foram distribuídos em 7 grupos: Controle Sham (CS; solução tampão citrato de sódio); Controle veículo do resveratrol (VR- carboximetilcelulose, veículo do resveratrol); Resveratrol (R); Diabético (D); Diabético-tratado-com-insulina (DI); Diabético-tratado-com-resveratrol (DR); Diabético-tratado-com-insulina + resveratrol (DIR). O Diabetes mellitus tipo1 (DM1) foi induzido nos animais no 30º dpp, com uma única injeção intraperitoneal de estreptozotocina (65 mg/kg). A glicemia foi monitorada aos 30, 33, 45, 64, 75, 100 e aos 110 dpp. Os grupos DR, DIR e R foram tratados com 150mg de resveratrol/kg de peso corpóreo/dia (administrado por gavagem), matinalmente, a partir do 33º dpp até o 110º dpp. Animais dos grupos DI e DIR receberam injeções subcutâneas de insulina NPH (Neutral Protamine Hagedorn), em dose de 1U/100g de peso corpóreo/por dia, a partir do 5º dia da indução do diabetes, até o 110dpp. Aos 100 dpp, todos os animais foram acasalados cada um com duas ratas Wistar adultas (n=84) primíparas e saudáveis, para avaliação dos índices de fertilidade e de gestação e da capacidade reprodutiva. Os machos foram submetidos à eutanásia aos 110dpp, para a coleta do material destinado à realização das análises espermáticas e à avaliação do estresse oxidativo testicular e epididimário. A análise espermática qualitativa compreendeu os seguintes ensaios: a) cometa (para investigar a fragmentação do DNA); b) Laranja de Acridina (Acridine Orange), para estudo da estrutura da cromatina e do DNA) e c) Cromomicina A3 (CMA3- para análise da compactação e protaminação da cromatina); estes últimos (itens b e c) foram aquilatados utilizando-se Citômetro de Fluxo. Também foram investigados (as): a motilidade dos espermatozoides (através de sistema de análise computadorizada); a integridade acrossômica (método do PNA- xiv Arachis hypogaea lectin); a massa mitocondrial (sonda Mitotracker Green), além dos índices de gestação e de fertilidade e da capacidade reprodutiva. Resultados: DM1 alterou significantemente os parâmetros espermáticos qualitativos e prejudicou os índices de fertilidade e gestação e a capacidade reprodutiva dos animais. Em consonância com outros parâmetros reprodutivos previamente avaliados por nosso grupo, nas mesmas condições experimentais, os resultados desta pesquisa ratificam a ação benéfica do resveratrol sobre a reprodução, melhorando a qualidade espermática em animais com DM1, no que concerne à motilidade, à massa mitocondrial e à integridade acrossômica. Similarmente, as administrações só de insulina e de insulina + resveratrol também melhoraram estes parâmetros. Os resultados demonstram que o tratamento promoveu, ainda, a melhora dos índices de fertilidade e de gestação em ratos diabéticos tratados com o resveratrol e/ou com insulina, em relação aos diabéticos não tratados. Conclusão: Considerando os dados positivos em relação à normalização da glicemia no DM1, a redução dos níveis de MDA (marcador de estresse oxidativo), tanto no testículo como no epidídimo, a melhora da qualidade do DNA espermático e os resultados reprodutivos, em ratos diabéticos tratados com RES, independentemente da terapia com insulina , acreditamos que o RES poderia ser considerado um adjuvante muito promissor para controlar a homeostase glicêmica e melhorar o estado de fertilidade associado ao DM1, isoladamente ou em conjunto com insulinoterapia.