Estudo do papel da Histidina quinase reguladora do dimorfismo (DRK1) do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis
Data
2021
Autores
Navarro, Marina Valente 
Orientadores
Batista, Wagner Luiz
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Thermal dimorphic fungi of Paracoccidioides genus are the causative agents of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic endemic disease in Latin America with high incidence in Brazil. This pathogen presents as infective mycelium at 25°C in the soil, reverting to its pathogenic form when inhaled by mammalian host (37°C). This ability to switch from mycelium to yeast form is essential to disease development. Among dimorphic fungus species, dimorphism regulating histidine kinase (Drk1) plays an essential role to morphological transition. Histidine kinases (HK) are very important as virulence and cellular survival regulators. These kinases are present in bacteria and fungi, but absent in mammalian cells. This evidence suggests that HKs are interesting pharmacological targets to fungal diseases. Recently, our group characterized P. brasiliensis DRK1 (PbDRK1) expression during mycelium-yeast transition. It was observed that this gene is predominantly expressed in pathogenic yeast phase. In addition, we verified that when Dkr1 pharmacological inhibitor (iDrk1) was incubated with mycelium at 37°C, it alters the dimorphic switch. Hence, the purpose of this study was to investigate the role of PbDrk1 in cell wall modulation of P. brasiliensis. Previous data indicates a correlation between PbDrk1 and MAP kinase Hog1 over osmotic stress condition. In the present work it was observed decreased Hog1 phosphorylation levels after incubation with iDrk1 over osmotic stress but also related with cell wall integrity, confirming the participation of this HK in Hog1 signaling pathway. Additionally, we observed that PbDrk1 participates in fungal resistance to different cell wall disturbing agents, such as Congo Red, Calcofluor White and sodium chloride, by reducing yeasts viability after treatment with iDrk1. In order to verify the role of PbDRK1 in cell wall morphogenesis, we performed RTqPCR analysis. The results indicated that samples previously exposed to iDrk1 presented higher expression levels in several genes related to cell wall modulation. Among the genes analyzed, we highlighted FKS1, a β-glucan synthase which was 3,6-fold increase when compared to no treatment control. Confocal microscopy analysis and flow cytometry showed higher β-glucan exposure in cell surface of P. brasiliensis after 24 h incubation with iDrk1. Accordingly, through phagocytosis assay, it was observed a significant higher phagocytic index in yeasts treated with iDrk1 than control group, evidencing the role of PbDrk1 in cell wall modulation, which becomes a relevant target to be investigated. In parallel, the immune response profile was also assayed, with increased levels of pro-inflammatory cytokines. It is important to highlight that iDrk1 concentration used on this study did not reduce yeast viability. Finally, our data strongly suggests that PbDrk1 modulates cell wall components expression,among which we can point out b-glucan. The comprehension of this signaling pathway may be of great value to identify targets to antifungal molecular activity, since HK are not present in mammals.
Fungos dimórficos e termo dependentes do gênero Paracoccidioides são os agentes causadores da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica e endêmica na América Latina com alta incidência no Brasil. Este fungo apresenta-se como micélio infeccioso no ambiente (25°C), revertendo à sua forma patogênica quando inalado pelo hospedeiro (37°C). A capacidade de mudar de micélio para levedura é essencial para o desenvolvimento da doença. Entre as espécies de fungos dimórficos, a histidina quinase reguladora do dimorfismo (Drk1) é necessária para a transição morfológica. As histidinas quinases (HK) têm grande importância como reguladoras de virulência e sobrevivência celular. Estas quinases estão presentes em bactérias e fungos, mas ausentes nas células de mamíferos, tornando-as um interessante alvo farmacológico para doenças fúngicas. Recentemente, nosso grupo caracterizou a expressão de DRK1 de P. brasiliensis (PbDRK1) durante a transição de micélio para levedura e verificamos que esse gene se encontra predominantemente expresso na fase de levedura. Além disso, foi observado bloqueio da transição de M-Y quando o inibidor farmacológico de histidina quinase (iDrk1) era utilizado. Assim, o objetivo deste trabalho foi entender o papel de PbDrk1 na modulação da parede celular do P. brasiliensis. Dados prévios do nosso grupo indicam uma correlação entre PbDrk1 e a regulação da MAP quinase Hog1 durante o estresse osmótico. No presente estudo foi observado redução da fosforilação em Hog1 após incubação com iDrk1 durante estresse osmótico e também na via de integridade da parede celular, confirmando a participação desta quinase na sinalização da via de Hog1. Além disso, foi observado que PbDrk1 participa da resistência do fungo a diferentes perturbadores de parede celular, tais como Vermelho Congo, Calcofluor White e cloreto de sódio, uma vez que foi observado redução da viabilidade celular nos fungos previamente tratados com iDrk. Para verificar o papel de PbDRK1 na morfogênese da parede celular, análises de RT-qPCR foram realizadas. Neste ensaio observou-se que as amostras tratadas com iDrk1 apresentaram aumento nos níveis de expressão em diferentes genes envolvidos com a modulação da parede celular. Entre estes genes destaca-se o FKS1, que codifica uma β-glucana sintase, a qual apresentou aumento de 3,6 vezes em relação ao grupo controle. Além disso, análises de microscopia confocal e citometria de fluxo mostraram aumento na exposição de β-glucana e quitina na parece celular de P. brasiliensis após 24 h de incubação com iDrk1. Consequentemente, foi observado que o índice fagocítico de leveduras tratadas com iDrk1 foi significativamente maior do que leveduras controle, evidenciando o papel de Drk1 na modulação da parede celular e tornando-a um relevante alvo a ser investigado. Adicionalmente também foi observada modulação da resposta imune com o aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias. Importante dizer que a concentração de iDrk1 utilizada neste estudo não diminuiu a viabilidade do fungo. Por fim, nossos dados indicam que PbDrk1 modula os componentes de parede celular, dentre os quais podemos destacar b-glucana. O entendimento desta via de sinalização pode ser um interessante alvo para ação de moléculas com atividade antifúngica, uma vez que HK não são encontradas em mamíferos.
Fungos dimórficos e termo dependentes do gênero Paracoccidioides são os agentes causadores da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica e endêmica na América Latina com alta incidência no Brasil. Este fungo apresenta-se como micélio infeccioso no ambiente (25°C), revertendo à sua forma patogênica quando inalado pelo hospedeiro (37°C). A capacidade de mudar de micélio para levedura é essencial para o desenvolvimento da doença. Entre as espécies de fungos dimórficos, a histidina quinase reguladora do dimorfismo (Drk1) é necessária para a transição morfológica. As histidinas quinases (HK) têm grande importância como reguladoras de virulência e sobrevivência celular. Estas quinases estão presentes em bactérias e fungos, mas ausentes nas células de mamíferos, tornando-as um interessante alvo farmacológico para doenças fúngicas. Recentemente, nosso grupo caracterizou a expressão de DRK1 de P. brasiliensis (PbDRK1) durante a transição de micélio para levedura e verificamos que esse gene se encontra predominantemente expresso na fase de levedura. Além disso, foi observado bloqueio da transição de M-Y quando o inibidor farmacológico de histidina quinase (iDrk1) era utilizado. Assim, o objetivo deste trabalho foi entender o papel de PbDrk1 na modulação da parede celular do P. brasiliensis. Dados prévios do nosso grupo indicam uma correlação entre PbDrk1 e a regulação da MAP quinase Hog1 durante o estresse osmótico. No presente estudo foi observado redução da fosforilação em Hog1 após incubação com iDrk1 durante estresse osmótico e também na via de integridade da parede celular, confirmando a participação desta quinase na sinalização da via de Hog1. Além disso, foi observado que PbDrk1 participa da resistência do fungo a diferentes perturbadores de parede celular, tais como Vermelho Congo, Calcofluor White e cloreto de sódio, uma vez que foi observado redução da viabilidade celular nos fungos previamente tratados com iDrk. Para verificar o papel de PbDRK1 na morfogênese da parede celular, análises de RT-qPCR foram realizadas. Neste ensaio observou-se que as amostras tratadas com iDrk1 apresentaram aumento nos níveis de expressão em diferentes genes envolvidos com a modulação da parede celular. Entre estes genes destaca-se o FKS1, que codifica uma β-glucana sintase, a qual apresentou aumento de 3,6 vezes em relação ao grupo controle. Além disso, análises de microscopia confocal e citometria de fluxo mostraram aumento na exposição de β-glucana e quitina na parece celular de P. brasiliensis após 24 h de incubação com iDrk1. Consequentemente, foi observado que o índice fagocítico de leveduras tratadas com iDrk1 foi significativamente maior do que leveduras controle, evidenciando o papel de Drk1 na modulação da parede celular e tornando-a um relevante alvo a ser investigado. Adicionalmente também foi observada modulação da resposta imune com o aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias. Importante dizer que a concentração de iDrk1 utilizada neste estudo não diminuiu a viabilidade do fungo. Por fim, nossos dados indicam que PbDrk1 modula os componentes de parede celular, dentre os quais podemos destacar b-glucana. O entendimento desta via de sinalização pode ser um interessante alvo para ação de moléculas com atividade antifúngica, uma vez que HK não são encontradas em mamíferos.