Investigation of NR2F2/COUP-TFII function during early gonadal development in humans and analysis of new genetic variants in individuals with SRY-negative 46,XX testicular/ovotesticular difference/disorder of sex development (DSD)
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Data
2024-04-23
Autores
Ferreira, Lucas Garcia Alves [UNIFESP]
Orientadores
Silva, Magnus Régios Dias da [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
Human gonadal development is established by balancing mutually antagonistic sex signaling networks. The pro-testicular pathway is triggered by SRY gene activation. Evi-dence has suggested the existence of a genetic module probably composed of more than one factor acting as the trigger for the pro-ovarian pathway. However, factors directing ovarian development are poorly understood, especially due to insufficient studies using appropriate models to investigate human ovary differentiation. The disruption of these signaling pathways may lead to differences/diversities/disorders of sex development (DSD), such as 46,XX testicular/ovotesticular DSD (46,XX T/OT-DSD). The SRY gene translocation explains part of 46,XX T/OT-DSD cases; however, many SRY-negative cases remain without molecular diagnosis. In recent years, genetic variants in NR2F2 (nuclear receptor subfamily 2 group F member 2), encoding the transcription factor COUP-TFII (chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 2), have been reported as novel causes of SRY-negative 46,XX T/OT-DSD. Our research team de-scribed a 3-Mb deletion containing NR2F2 in an individual with SRY-negative 46,XX OT-DSD, atypical male external genitalia, cardiac defects, and dysmorphic facial features. However, the genetic network regulated by COUP-TFII in human gonadal somatic cells is unknown. We aimed to investigate the mechanisms underlying the development of tes-ticular tissue in 46,XX individuals with loss-of-function variants in NR2F2 and to search for new genetic variations in SRY-negative 46,XX T/OT-DSD cases with no genetic diag-nosis. We generated an NR2F2 complete knockout (KO) in the human granulosa-like cell line COV434 and studied NR2F2-KO COV434 cell transcriptome using RNA sequencing. We also generated heterozygous and homozygous NR2F2-KO induced pluripotent stem cell (iPSC) lines from human fibroblasts using a one-step protocol for CRISPR/Cas9 gene-editing and episomal-based reprogramming. iPSCs were submitted to a stepwise protocol for differentiation into primitive streak-mesendoderm, intermediate mesoderm, and granulosa-like cells. We identified that COUP‑TFII is expressed in early supporting gonadal cells (ESGC) and regulates transcript profiles associated with early bipotent gonadal state and the first wave of pre‑granulosa cells. During the differentiation of iPSCs into granulosa-like cells, both hetero and homozygous NR2F2-KO cell lines upregulated EMX2 gene, whereas LHX9 was downregulated at protein and mRNA levels in the ho-mozygous cell line. EMX2 and LHX9 are players in the early development of the bipoten-tial gonad. The heterozygous NR2F2-KO cells expressed higher levels of both FOXL2 and AMH, markers of granulosa and fetal Sertoli cells, respectively, than their wild-type counterparts. Our findings suggest that COUP-TFII regulates the transcriptional plasticity of ESGCs and cell fate during gonad development, and NR2F2/COUP-TFII haploinsufficiency may lead to 46,XX OT-DSD through the dysregulation of bipotential gonad factors instead of downregulation of pro-ovarian genes. Finally, we performed singleton whole-genome sequencing (sWGS) and comparative genomic hybridization array (CGH-array) on two unrelated cases with no family history and one case with a family history of SRY-negative 46,XX T/OT-DSD. We detected a heterozygous 3.3 kb deletion encompassing the 3’UTR of CRIPTO gene in members of this family. However, this genetic variation was not found in one affected sibling. The affected family members present differences in their phenotypes since one individual has testicular DSD, and two others present ovotestis. Therefore, we raised the hypothesis that this inherited microdeletion in the CRIPTO locus may contribute to the variable expressivity of the phenotype in this family. Further investigations are necessary to test this hypothesis. The use of in vitro human models and a combination of next-generation sequencing and cytogenetic studies are necessary to increase our knowledge about the genetic mechanisms underlying sex development and its variations and to iden-tify new DSD candidate genes. Applying new methods, such as long-read sequencing, is a promising strategy for studying DSD cases with no molecular etiology.
O desenvolvimento gonadal em humanos é estabelecido a partir do balanço entre vias de sinalização do sexo mutuamente antagônicas. A via pró-testicular tem como gati-lho a ativação do gene SRY. Evidências têm sugerido a existência de um módulo genéti-co, provavelmente composto por mais de um fator, como o gatilho para a via pró-ovariana. Entretanto, os fatores responsáveis pelo desenvolvimento do ovário são pouco conhecidos, especialmente devido à falta de estudos que utilizem modelos apropriados para investigar a diferenciação ovariana. A desregulação dessas vias de sinalização po-de levar a diferenças/diversidades/distúrbios do desenvolvimento do sexo (DDS), como a DDS testicular/ovotesticular 46,XX (DDS-T/OT 46,XX). A translocação do gene SRY explica parte dos casos de DDS-T/OT 46,XX; no entanto, muitos casos SRY-negativos permanecem sem diagnóstico molecular. Recentemente, variantes genéticas de NR2F2 (nuclear receptor subfamily 2 group F member 2), que codifica o fator de transcrição COUP-TFII (chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 2), têm sido re-portadas como novas causas de DDS-T/OT 46,XX SRY-negativo. Nosso grupo de pes-quisa descreveu uma deleção de 3 Mb contendo o NR2F2 em um indivíduo com DDS-OT 46,XX SRY-negativo, genitália externa macho atípica, malformações cardíacas e características dismórficas da face. No entanto, a rede de genes regulada por COUP-TFII em células somáticas gonadais humanas é desconhecida. Nosso objetivo foi inves-tigar os mecanismos associados ao desenvolvimento de tecido testicular em indivíduos 46,XX com variantes de perda de função em NR2F2 e buscar por novas variantes gené-ticas em casos de DDS-T/OT 46,XX SRY-negativo sem diagnóstico genético. Nós gera-mos um knockout (KO) completo de NR2F2 na linhagem de células semelhantes à gra-nula COV434 e estudamos o transcriptoma das células COV434 NR2F2-KO usando se-quenciamento de RNA. Nós também geramos linhagens de célula-tronco pluripotente induzida (iPSC) heterozigota e homozigota para NR2F2-KO utilizando um protocolo de uma etapa para edição gênica por CRISPR/Cas9 e reprogramação baseada em episso-ma. As iPSCs foram submetidas a um protocolo para diferenciação em células da linha primitiva-mesendoderma, mesoderma intermediário e células semelhantes à granulosa. Nós identificamos que COUP-TFII é expresso em células iniciais de suporte gonadal (ESGCs) e regula perfis de transcrição associados aos estágios iniciais da gônada bipo-tencial e à primeira onda de células pré-granulosa. Durante a diferenciação de iPSCs em células semelhantes à granulosa, ambas linhagens celulares heterozigota e homozigota para a deleção de NR2F2 regularam positivamente o gene EMX2, enquanto LHX9 foi regulado negativamente a nível de proteína e RNAm na linhagem de células homozigotas. EMX2 e LHX9 atuam no desenvolvimento inicial da gônada bipotencial. As células heterozigotas para a deleção de NR2F2 expressaram maiores níveis de FOXL2 e AMH, marcadores de células da granulosa e Sertoli fetal, respectivamente, em comparação às células-controle. Nossos achados sugerem que COUP-TFII regula a plasticidade transcricional de ESGCs e o destino celular durante o desenolvimento gonadal, e que a haploinsuficiência de NR2F2/COUP-TFII pode levar a DDS-OT 46,XX por meio da desregulação de fatores da gônada bipotencial ao invés da regulação negativa de genes pró-ovarianos. Finalmente, realizamos sequenciamento completo do genoma em singleton (sWGS) e hibridização genômica comparativa em array (CGH-array) em dois casos não relacionados e sem histórico familiar e um caso com histórico familiar de DDS-T/OT 46,XX SRY-negativo. Detectamos uma deleção em heterozigose de 3.3 kb contendo a região 3’UTR do gene CRIPTO em membros dessa família. Entretanto, essa variação genética não foi obser-vada em um dos indivíduos afetados. Os membros da família afetados apresentam dife-renças em seus fenótipos, havendo um indivíduo com DDS testicular e outros dois com ovotestis. Portanto, levantamos a hipótese de que essa microdeleção herdada no lócus do gene CRIPTO pode contribuir para a expressividade variável do fenótipo nessa famí-lia. Investigações adicionais são necessárias para testar essa hipótese. O uso de mode-los humanos in vitro e a combinação de sequenciamento de nova geração e estudos ci-togenéticos são necessários para expandir nosso conhecimento acerca dos mecanismos genéticos associados ao desenvolvimento do sexo e suas variações, e para identificar novos genes candidatos para DDS. A aplicação de novos métodos como o sequencia-mento do tipo long-read é uma estratégia promissora para estudar casos de DDS que permanecem sem diagnóstico molecular.
O desenvolvimento gonadal em humanos é estabelecido a partir do balanço entre vias de sinalização do sexo mutuamente antagônicas. A via pró-testicular tem como gati-lho a ativação do gene SRY. Evidências têm sugerido a existência de um módulo genéti-co, provavelmente composto por mais de um fator, como o gatilho para a via pró-ovariana. Entretanto, os fatores responsáveis pelo desenvolvimento do ovário são pouco conhecidos, especialmente devido à falta de estudos que utilizem modelos apropriados para investigar a diferenciação ovariana. A desregulação dessas vias de sinalização po-de levar a diferenças/diversidades/distúrbios do desenvolvimento do sexo (DDS), como a DDS testicular/ovotesticular 46,XX (DDS-T/OT 46,XX). A translocação do gene SRY explica parte dos casos de DDS-T/OT 46,XX; no entanto, muitos casos SRY-negativos permanecem sem diagnóstico molecular. Recentemente, variantes genéticas de NR2F2 (nuclear receptor subfamily 2 group F member 2), que codifica o fator de transcrição COUP-TFII (chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 2), têm sido re-portadas como novas causas de DDS-T/OT 46,XX SRY-negativo. Nosso grupo de pes-quisa descreveu uma deleção de 3 Mb contendo o NR2F2 em um indivíduo com DDS-OT 46,XX SRY-negativo, genitália externa macho atípica, malformações cardíacas e características dismórficas da face. No entanto, a rede de genes regulada por COUP-TFII em células somáticas gonadais humanas é desconhecida. Nosso objetivo foi inves-tigar os mecanismos associados ao desenvolvimento de tecido testicular em indivíduos 46,XX com variantes de perda de função em NR2F2 e buscar por novas variantes gené-ticas em casos de DDS-T/OT 46,XX SRY-negativo sem diagnóstico genético. Nós gera-mos um knockout (KO) completo de NR2F2 na linhagem de células semelhantes à gra-nula COV434 e estudamos o transcriptoma das células COV434 NR2F2-KO usando se-quenciamento de RNA. Nós também geramos linhagens de célula-tronco pluripotente induzida (iPSC) heterozigota e homozigota para NR2F2-KO utilizando um protocolo de uma etapa para edição gênica por CRISPR/Cas9 e reprogramação baseada em episso-ma. As iPSCs foram submetidas a um protocolo para diferenciação em células da linha primitiva-mesendoderma, mesoderma intermediário e células semelhantes à granulosa. Nós identificamos que COUP-TFII é expresso em células iniciais de suporte gonadal (ESGCs) e regula perfis de transcrição associados aos estágios iniciais da gônada bipo-tencial e à primeira onda de células pré-granulosa. Durante a diferenciação de iPSCs em células semelhantes à granulosa, ambas linhagens celulares heterozigota e homozigota para a deleção de NR2F2 regularam positivamente o gene EMX2, enquanto LHX9 foi regulado negativamente a nível de proteína e RNAm na linhagem de células homozigotas. EMX2 e LHX9 atuam no desenvolvimento inicial da gônada bipotencial. As células heterozigotas para a deleção de NR2F2 expressaram maiores níveis de FOXL2 e AMH, marcadores de células da granulosa e Sertoli fetal, respectivamente, em comparação às células-controle. Nossos achados sugerem que COUP-TFII regula a plasticidade transcricional de ESGCs e o destino celular durante o desenolvimento gonadal, e que a haploinsuficiência de NR2F2/COUP-TFII pode levar a DDS-OT 46,XX por meio da desregulação de fatores da gônada bipotencial ao invés da regulação negativa de genes pró-ovarianos. Finalmente, realizamos sequenciamento completo do genoma em singleton (sWGS) e hibridização genômica comparativa em array (CGH-array) em dois casos não relacionados e sem histórico familiar e um caso com histórico familiar de DDS-T/OT 46,XX SRY-negativo. Detectamos uma deleção em heterozigose de 3.3 kb contendo a região 3’UTR do gene CRIPTO em membros dessa família. Entretanto, essa variação genética não foi obser-vada em um dos indivíduos afetados. Os membros da família afetados apresentam dife-renças em seus fenótipos, havendo um indivíduo com DDS testicular e outros dois com ovotestis. Portanto, levantamos a hipótese de que essa microdeleção herdada no lócus do gene CRIPTO pode contribuir para a expressividade variável do fenótipo nessa famí-lia. Investigações adicionais são necessárias para testar essa hipótese. O uso de mode-los humanos in vitro e a combinação de sequenciamento de nova geração e estudos ci-togenéticos são necessários para expandir nosso conhecimento acerca dos mecanismos genéticos associados ao desenvolvimento do sexo e suas variações, e para identificar novos genes candidatos para DDS. A aplicação de novos métodos como o sequencia-mento do tipo long-read é uma estratégia promissora para estudar casos de DDS que permanecem sem diagnóstico molecular.
Descrição
Citação
FERREIRA, Lucas Garcia Alves. Investigation of NR2F2/COUP-TFII function during early gonadal development in humans and analysis of new genetic variants in individuals with SRY-negative 46,XX testicular/ovotesticular difference/disorder of sex development (DSD). 2024. 234 f. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). São Paulo, 2024.